Изучение физиолого-биохимических свойств дрожжей-сахаромицетов в зависимости от приуроченности к растительному субстрату

Современная технология отечественных вин основана на использовании чистых культур дрожжей Saccharomyces cerevisiae с известными свойствами, которые способствуют соблюдению режимов производства и обеспечивают качество продукции. Для получения виноградных и плодово-ягодных вин обычно применяются дрожжи, выделенные с одноименных растительных субстратов. Дифференцированный подход к выбору культур обусловлен особенностями обмена клетки, которые, возможно, являются результатом их адаптации к первоначальному источнику обитания в природе. Исследования физиолого-биохимических признаков сахаромицетов в зависимости от приуроченности к виду растения, дополняя сведения о метаболизме эукариотической клетки, способствуют скринингу ценных для производства штаммов. Изучение жизнедеятельности дрожжей в этом аспекте составило цель наших исследований .

Известно, что специфической средой обитания дрожжей, применяемых в виноделии, являются виноград и плодово-ягодные растения. В работе использовали штаммы, изолированные с ягод винограда и плодов абрикоса, которые собирали и раздавливали с соблюдением необходимых мер стерильности, предусмотренных в

Магомедов Гаджи Гасайникадиевич, научный сотрудник микробиологии [1, 2]. Спонтанно забродившее сусло рассеивали на агаризованную среду в чашках Петри, которые инкубировали при температуре 18-200С. Выросшие изолированно колонии после предварительного микроскопирования выделяли в культуры и для идентификации вида проводили диагностическое тестирование по культурально-морфологическим признакам, согласно определителям и пособиям [14]. Выделенные культуры хранили в холодильнике на скошенной агаризованной среде и пересеивали каждые 4-6 месяцев.

О метаболизме дрожжей, культивируемых на абрикосовой и виноградной среде, судили по значению показателей, во многом определяющих эффективность технологического процесса – энергии брожения, количеству образовавшегося этилового спирта, несброженных сахаров, титруемых кислот и компонентов летучего комплекса. В работе использовали двухсуточные дрожжевые разводки, которые вводили из расчёта 3 млн. клеток/см3. При определении скорости разложения сахаров опыты ставили в склянках объёмом 100 см3, закрытых пробками с отверстием, куда вставлялась трубка с тонко оттянутым концом в несколько сантиметров для выхода углекислоты и предотвращения испарения бродящего сока. По ежедневной убыли в массе, соответствующей количеству выделившегося углекислого газа, судили о скорости сбраживания сахаров. Температура брожения колебалась в пределах 22-250С. Количество этанола, остаточных сахаров, титруемых кислот, средних эфиров в сброженных средах определяли в соответствии с действующими ГОСТами [5]. Комплекс летучих компонентов исследовали на газовом хроматографе

«Кристалл-200М» с пламенно-ионизационном детектором на капиллярной колонке НР-FFAР (50 м х0,32 мм) с 10%-ным диэтилленгликоль-сукцинатом, газ-носитель азот (1,8-2,7 дм3 /ч).

Результаты изучения скорости сбраживания сахаров, являющейся одной из важных характеристик углеводного обмена дрожжей показали, что при культивировании на родственной среде они проявляли большую активность. На рис. 1 и 2 представлена энергия брожения двух штаммов, на примере которых очевидно преимущество каждого на одноименном субстрате. Так, плодовому штамму для утилизации 90% сахаров, содержащихся в абрикосовом соке, потребовалось 7-8 дней, а виноградному – более 25 (рис. 1). При жизнедеятельности этих культур в виноградном сусле более энергичным оказался виноградный штамм (рис. 2). Результаты данного эксперимента свидетельствуют о влиянии адаптированности дрожжей к определенному растительному субстрату на их энергию брожения. При анаэробной диссимиляции углеводов наряду с образованием основных продуктов жизнедеятельности дрожжей – спирта и диоксида углерода, синтезируются вторичные и побочные продукты брожения, обусловливающие букет и вкус вина.

Рис.1. Энергия брожения штаммов на абрикосовом соке

Научный и практический интерес вызывало исследование влияния приуроченности дрожжей к определенному субстрату, на способность к продуцированию этих соединений при их культивировании в средах, полученных из различных видов растительного сырья. В качестве объекта изучения были выбраны штаммы (1-А; 2-А), изолированные с абрикосов, которые инокулировали в абрикосовый (варианты 1, 2) и виноградный (варианты 3, 4) соки, сахаристостью, г/100 см3 - 13,7; 20,6 и титруемой кислотностью, г/дм3 - 3,6; 8,0, соответственно. Дрожжи вводили в количестве 3 млн. кле-ток/см3, брожение проводили до его естественной остановки.

Рис. 2. Энергия брожения штаммов на виноградном соке

Согласно полученным данным, приведенным в таблице, при культивировании плодовых дрожжей на обеих средах состав сброженных субстратов колебался в зависимости от индивидуальных особенностей штамма. Жизнедеятельность плодовых культур в вариантах 1, 2 сопровождалась полным выбраживанием сахаров, в отличие от вариантов 3, 4, где питательной средой служил виноградный сок. В последних отмечали значительно большее количество остаточных сахаров, что может быть связано с тем, что дрожжи при культивировании на виноградном соке отличались меньшей интенсивностью брожения, чем в абрикосовом. Во всех вариантах наблюдали повышение уровня титруемых кислот.

Способность к образованию компонентов летучего комплекса – летучих кислот, ацетальдегида, эфиров, высших спиртов (ВС), количество которых колебалось в пределах – 0,2-1,1 г/дм3, 12,9-63,5 мг/дм3, 39,4-99,9 мг/дм3, 169,2232,4 мг/дм3, соответственно, зависела от особенностей штамма и среды культивирования. При этом жизнедеятельность плодовых культур на виноградном соке сопровождалась меньшим продуцированием ацетальдегида и высших спиртов, в том числе изобутанола, изоамилола и усилением синтеза пропанола-1, бутанола-1, гексанола, фенилалэтанола, а также летучих кислот. Одинаковая направленность в количественном изменении вышеперечисленных соединений при инокулировании штаммов с различными индивидуальными свойствами в инородную среду, по-видимому, является проявлением метаболических особенностей, характерных для всех дрожжевых клеток, возникающих в результате приуроченности их к определённому растительному субстрату, и не зависит от штаммовой принадлежности. В связи с отмеченными тенденциями, о специфичности метаболизма плодовых дрожжей в этой среде, на наш взгляд, можно судить, сравнивая данные субстрате, сброженном на штаммах, выделенных об уровне образования летучих кислот, аце- с винограда и результаты вариантов 3, 4, при-тальдегида и высших спиртов в виноградном ведённых в таблице.

Таблица. Поведение штаммов в различных субстратах

Для получения сведений о способности дрожжей, изолированных с винограда, к синтезу этих летучих соединений, поставили серию опытов, где использовали виноградный сок из различных микрорайонов с сахаристостью, г/100 см3 - 20,1; 21,0 и титруемой кислотностью, г/дм3 – 5,8; 7,7, который сбраживали на трёх природных и двух коллекционных штаммах по методике, изложенной выше. Согласно экспериментальным данным, во всех опытах, независимо от состава питательной среды и свойств штамма, отмечали полное выбражива-ние сахаров и возрастание количества титруемых кислот, которое как и продуцирование дрожжами этанола и соединений летучего комплекса – летучих кислот, ацетальдегида и высших спиртов варьировало в зависимости от штамма. Минимальная и максимальная концентрация этих компонентов, полученная в наших исследованиях, приведена в таблице – варианты 5 и 6, соответственно.

Сравнение результатов по продуцированию плодовыми и виноградными дрожжами летучих соединений показало, что максимальное количество летучих кислот, бутанола-1 и пропанола-1, было в вариантах 3, 4, а ацетальдегида, гексанола, фенилэтанола приближалось к значениям, характерным для виноградных дрожжей. Образование изоамилола, как известно обладающего неприятным сивушным оттенком и являющегося наиболее токсичным из спиртов, у плодовых штаммов отмечали в меньших количествах, чем у последних. В целом, биосинтезирующая способность плодовых культур в виноградном сусле сравнима со штаммами, приуроченными к винограду, что, по-видимому, обусловлено влиянием состава этой питательной среды на метаболизм дрожжей-сахаромицетов.

В литературе имеются сведения об эффективном использовании штаммов, изолированных с определённых растительных субстратов, в средах, не характерных для их жизнедеятельности. Так, например, показана способность дрожжей, выделенных с ягод черной смородины, к активному сбраживанию не только чёрносмородинового, но и яблочного сусла. Большинство из них на родственном соке образуют больше углекислого газа, этанола, биомассы, меньше вторичных метаболитов, в том числе ацетальдегида [6]. Известно, что ацетальдегид, являющийся важным продуктом обмена клетки, имеет большое технологическое значение, так как участвуя в синтезе многих соединений, влияет на формирование качества виноматериалов. В связи с этим полученные нами сведения о продуцировании природными дрожжами уксусного альдегида в разных плодово-ягодных соках, могут быть полезны при подборе штаммов. Дегустация опытных виноградных и абрикосовых напитков показала, что независимо от приуроченности использованного штамма к растительному субстрату, их цвет, вкус и аромат соответствовали требованиям, предъявляемым при производстве натуральных спиртосодержащих напитков из этого сырья.

Выводы: проявление отдельных физиолого-биохимических признаков природных штаммов, изолированных с винограда и плодов абрикоса, может быть обусловлено их первичной адаптацией к растительным субстратам. Метаболические особенности, отмечаемые при культивировании этих дрожжей на инородных средах, не исключают возможности использования их для приготовления из последних качественных спиртосодержащих напитков. Получение сведений о характере связи между приуроченностью дрожжей-сахаромицетов к субстрату обитания и их жизнедеятельностью на плодово-ягодных соках различного вида, сделает поиск штаммов в интересах биотехнологии более целенаправленным.