Изучение генетического разнообразия генотипов дикого граната (Punica granatum L.) Азербайджана с использованием маркеров ISSR

Введение. Дикий гранат ( Punica granatum L.) хорошо адаптирован к широкому спектру климатических условий и поэтому имеет широкое географическое распространение. Естественный рост диких гранатовых деревьев наблюдается в Центральной Азии, включая Иран, Афганистан и Южный Кавказ, а также в северо-западной Индии [1]. Растения граната характеризуются высокой адаптивностью к абиотическому стрессу, благодаря чему он широко возделывается в тропических и субтропических районах Средиземноморья (Египет, Марокко, Испания, Турция и Тунис) [2].

Географическое расположение и разнообразие почвенно-климатических условий Азербайджана, являющегося центром образования некоторых видов растений, способствовало богатому разнообразию культурных растений. История страны неразрывно связана с культурой возделывания граната, имеющего большой ареал распространения и богатое биологическое разнообразие из-за благоприятных условий выращивания. Гранат – один из широко культивируемых плодовых растений. Не удивительно, что гранат считается одним из национальных символов Азербайджана. Поэтому изучение генетического разнообразия растений граната, идентификация генотипов представляет большой научный интерес. Растения граната в основном изучались по морфологическим признакам [3]. Эти показатели, являясь важными при идентификации образцов, не позволяют оценить большое количество растений, подвергнутых действию окружающей среды [4]. Для оценки этой культуры и во избежание дублирования помимо морфологических признаков необходимо охарактеризовать каждый генотип, изучив его генетический профиль с помощью методов, основанных на ДНК-маркерном анализе [5, 6].

Цель исследования : изучение генотипов дикого граната Азербайджана из 6 географических районов.

Результаты исследований позволят проводить селекционные работы в различных направлениях.

Материал и методы исследования . Исследование проводилось в лаборатории биотехнологии Института генетических ресурсов Национальной Академии Наук Азербайджана в 2015–2018 гг. Объектом для исследования явились 90 образцов граната, фрагменты листьев которых были собраны из 6 районов Азербайджана (табл. 1).

Молекулярный анализ. При выделении геномной ДНК брали навески по 0,1 г из свежесобранных листьев, согласно ЦТАБ (цетилтриме-тиламмониум бромид) протоколу, предложенному Doyle et Doyle с некоторыми модификациями [7]. Концентрацию и степень чистоты молекулы ДНК определяли с помощью НаноДропа (Thermo, NANO DROP, 2000). Конеч-ный объем реакционной смеси образца для ПЦР составлял 20 мкл, содержащей 2 мкл 10×ПЦР буфера; 2 мкл смеси dNTP (5 мM); 1,5 мкл MgCl2 (50 мM); 2 мкл каждого праймера (15 пмоль/мкл); 0,1 мкл фермента Taq полимеразы (1 U/мкл) и 2 мкл выделенной ДНК (50 нг/мкл). Для мультилокусного межмикро-сателлитного анализа были использованы 14 полиморфных ISSR праймеров длиной 11–18 нуклеотидов. В результате проведенной оптимизации были выбраны следующие условия амплификации: предварительная денатурация при температуре 94 °C в течение 5 мин, последующие 35 циклов – денатурация 94 °С (1 мин), температура отжига в зависимости от использованного праймера (45 с), синтез – 5 мин при 72 °C, финальный цикл элонгации при температуре 72 °C в течение 10 мин. Амплификацию проводили в программируемом термоциклере T100 (Applied Biosystems, USA). Электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 2 %-м агарозном геле с добавлением этидиум бромида и визуализировали под ультрафиолетовым светом с использованием гель-документирую-щей системы BioRad.

Таблица 1

Номер	Место сбора	Код	Номер	Место сбора	Код	Номер	Место сбора	Код
1	Агсу	A1	31	Исмаиллы	И1	61	Самух	Ca1
2		A2	32		И2	62		Ca2
3		A3	33		И3	63		Ca3
4		A4	34		И4	64		Ca4
5		A5	35		И5	65		Ca5
6		A6	36		И6	66		Ca6
7		A7	37		И7	67		Ca7
8		A8	38		И8	68		Ca8
9		A9	39		И9	69		Ca9
10		A10	40		И10	70		Ca10
11		A11	41		И11	71		Ca11
12		A12	42		И12	72		Ca12
13		A13	43		И13	73		Ca13
14		A14	44		И14	74		Ca14
15		A15	45		И15	75		Ca15
16	Габала	Га1	46	Гёйчай	Гё1	76	Сабирабад	C1
17		Га2	47		Гё2	77		C2
18		Га3	48		Гё3	78		C3
19		Га4	49		Гё4	79		C4
20		Га5	50		Гё5	80		C5
21		Га6	51		Гё6	81		C6
22		Га7	52		Гё7	82		C7
23		Га8	53		Гё8	83		C8
24		Га9	54		Гё9	84		C9
25		Га10	55		Гё10	85		C10
26		Га11	56		Гё11	86		C11
27		Га12	57		Гё12	87		C12
28		Га13	58		Гё13	88		C13
29		Га14	59		Гё14	89		C14
30		Га15	60		Гё15	90		C15

Генотипы дикого граната, собранные в разных регионах Азербайджана

Статистическая обработка полученных данных. Анализ амплифицированных фрагментов был проведен с помощью компьютерной программы PAST [8]. Построение дендрограммы и оценка генетической близости между об- разцами проводили на основе индекса генетического сходства Жаккарда, кластеризация осуществлялась с помощью метода UPGMA.

Коэффициент генетического разнообразия вычислялся согласно формуле Вейра [9]:

ИГР=1-∑^pi2 , где ИГР – индекс генетического разнообразия; Pi – частота встречаемости аллелей.

Для анализа информационного полиморфизма были использованы некоторые статистические параметры: PIC [10].

Значение PIC для каждого локуса вычислялось согласно формуле, предложенной Roldan-Ruiz [11]:

PICi=2fi(1 – fi), где PICi – PIC для локуса i; fi – частотавстречае-мости амплифицированных фрагментов (присутствующие спектры); (1 – fi) – частота встречаемости не амплифицированных фрагментов (отсутствующие спектры). Среднее значение PICi по всем изученным локусам для каждого праймера дает нам величину PIC.

Результаты исследования и их обсуждение

ISSR полиморфизм

Тестирование 20 праймеров позволило выявить 14 наиболее эффективных для дальнейшего анализа, с использованием которых было идентифицировано 110 фрагментов, из которых 86 (78 %) оказались полиморфными, 24 (22 %) – мономорфными.

В среднем один праймер инициировал синтез 7,8 фрагментов. Наибольшее количество ампликонов было детектировано для праймера UBC 811. Количество полиморфных фрагментов ДНК варьировало от 3 до 9. Минимальное число идентифицировалось праймерами UBC 827 и UBC 857, максимальное – при амплификации ДНК с праймерами UBC 811 и UBC 840.

Среднее число полиморфных фрагментов на праймер составило 6,1. Определено варьирование количества полиморфных локусов в зависимости от праймера: от 57 до 100 %. В среднем уровень полиморфизма, выявленный ISSR-анализом, составил 78 %. Для праймера UBC 811 и IS15 определен 100 % уровень полиморфизма (табл. 2). В данном исследовании по каждому ISSR-локусу был вычислен индекс генетического разнообразия (ИГР). Среднее значение ИГР для всей изученной коллекции равнялось 0,77. Высокие значения индекса были выявлены праймерами IS 15, UBC 811 и HB 14 (0,92; 0,90 и 0,90 соответственно).

ISSR-праймеры и их статистические параметры

Таблица 2

Праймеры	Тип повторяющейся последовательности	КАФ	КПФ	PIC	Полиморфизм, %	ИГР
UBC 808	(AG) 8 C	8	7	0,39	88	0,70
UBC 810	(GA) 8 T	7	4	0,28	57	0,67
UBC 811	(GA) 8 C	10	9	0,44	90	0,90
UBC 812	(GA) 8 A	7	5	0,36	71	0,83
UBC 827	(AC) 8 G	5	3	0,28	60	0,33
UBC 834	(AG) 8 YT	8	6	0,36	75	0,80
UBC 840	(GA) 8 TT	10	6	0,32	60	0,81
UBC 857	(AC) 8 TT	5	3	0,34	60	0,70
UBC 868	(GAA) 6	9	7	0,41	78	0,85
HB 14	(CTC) 3 GC	8	7	0,43	88	0,90
ISSR 3	TGT (AC) 7 A	7	5	0,40	71	0,70
ISSR 16	CGT(CA) 7 C	8	8	0,48	100	0,90
IS 11	(AGC) 6 G	9	7	0,25	78	0,84
IS 15	(GA) 8 CG	9	9	0,43	100	0,92
Всего	-	110	86	-	-	-
Среднее значение	-	7,8	6,1	0,39	78	0,77

Изучение генетического разнообразия сортов и популяций дикого граната исследователи разных стран проводили с использованием различных молекулярных маркеров. Так, генетическое разнообразие популяций граната из Китая и культурных сортов Туниса было оценено с использованием AFLP, являющегося одним из наиболее широко используемых в исследованиях [12, 13]. M. Talebi и др., используя 13 RAPD-праймеров для характеристики 28 генотипов граната из коллекции Йезд Ирана, выявили низкий уровень полиморфизма, объяснив это тем, что исследованные сорта были либо клонированы, либо вегетативно размножены [14]. Такие же результаты были получены Sarkhosh и др. [15], изучившими с использованием RAPD-анализа генотипы граната из Ирана. Эффективность исследования молекулярными маркерами оценивается выявленным им уровнем полиморфизма. ISSR относится к классу молекулярных маркеров, основанных на межтандемных повторах коротких ДНК последовательностей. Эти межмикросателлитные повторы выявляют высокий полиморфизм даже среди близкородственных генотипов, благодаря отсутствию функциональных ограничений в этих не кодирующих регионах [16]. ISSR – эффективный молекулярный маркер, характеризующий генетическую изменчивость в популяциях дикого граната [17].

В наших исследованиях все 14 ISSR-праймеров, апробированных нами, проявили себя полиморфными, т. е. эффективными для генотипирования образцов граната. В результате инициирования синтеза 110 фрагментов выявлен высокий уровень полиморфизма, составивший 78 %. Полученные данные согласуются с результатами исследований Narzary и др., установивших с применением 17 ISSR-праймеров полиморфизм на уровне 76,5 % [18]. Причина высокого полиморфизма межмикросателлитных маркеров может быть обусловлена их мульти-аллельной природой и гипервариабельностью. Наибольшая частота встречаемости полиморфных локусов отмечена при использовании праймеров с динуклеотидным повтором (AG)8, использование которого позволило выявить 100 % полиморфизм, что согласуется с исследованиями Carvalho и др., установившими эффективность применения праймеров ISSR, включаю- щих повторы (AG)n [19]. Эффективность использования ISSR-маркеров с целью определения полиморфизма ДНК отмечалась ранее и в других исследованиях. El Amine Ajal с сотрудниками [20], оценивая генетическое разнообразие 27 сортов граната из Марокко с помощью 8 ISSR-праймеров, выявили 70 фрагментов, 61 из которых были полиморфными. Индекс генетического расстояния Нея варьировал от 0,12 до 1 и в среднем был равен 0,67, что позволило сделать вывод об эффективности использования ISSR-маркеров для оценки полиморфизма и генетического разнообразия генотипов граната. В нашем исследовании по всем ISSR-локусам был вычислен индекс генетического разнообразия, среднее значение которого составило 0,67. Высокий показатель генетического разнообразия был выявлен праймерами UBC 812 и UBC 811 (0,83 и 0,90 соответственно). На информативность этих праймеров указывал и Z. Noormo-hammadi [21]. Полученные нами данные о высоком уровне ИГР свидетельствуют о богатом генетическом разнообразии коллекции граната, собранной из различных регионов Азербайджана.

Для оценки информационного полиморфизма был применен ряд статистических подходов. Маркерные системы различают по мере их информативности, что, в свою очередь, зависит от степени их полиморфизма. Одним из основных параметров, определяющих меру информативности маркеров, является величина информационного полиморфизма (PIC). Как известно, для доминантных маркеров значение PIC изменяется от 0 до 0,5, поскольку для такого типа маркеров допускается только два аллеля на локус и обе величины подвержены влиянию числа и частоты аллелей [22]. Из исследованных нами 86 полиморфных локусов наиболее информативными проявили себя 40 (PIC i > 0,40). Наиболее высокий показатель PIC (0,48) отмечен с применением праймера ISSR 16 с динуклеотидным повтором (CA) 7 (см. табл. 2). Для большинства изученных локусов выявлены средние значения PIC, которые колебались в пределах 0,25–0,44, средние и высокие показатели которых достаточны для идентификации и оптимальны для дифференциации изученных групп генотипов.

Дендрограмма, построенная по результатам ISSR-анализа на основе индекса генетического сходства Жаккарда

Высокое значение PIC для ISSR-праймеров может быть объяснено высокой информативностью маркеров [23]. Полученные нами значения PIC значительно превышают подобные данные в исследованиях M. Talebi и др. [14], у которых среднее значение PIC было равно 0,163, находилось в пределах 0,099–0,257, а также D. Narzary и др. [18], у которых среднее значение было равно 0,15, находясь в пределах 0,12– 0,21. В исследованиях Z. Noormohammadi при изучении с помощью 6 ISSR-праймеров 36 генотипов граната значение PIC колебалось в пределах 0,272 (UBC 834) – 0,494 (UBC 811), что согласуется с нашими результатами [21].

Кластерный анализ позволил дифференцировать большинство исследованных образцов (рис.). Количество сгруппированных образцов на дендрограмме варьировалось от 14 до 32. Наиболее многочисленным был кластер 3, в котором было локализовано 32 образца, что составило 35 % всех изученных генотипов. Следует отметить, что в этом кластере объединены генотипы, собранные в Агсуинском регионе. В этот кластер вошли также 13 из 15 генотипов граната, собранных в Габале. Третий кластер дендрограммы объединил 2 генотипа из Исма-иллы и генотипа из Гейчая.

Результаты кластерного анализа выявили группировку некоторых сортов в зависимости от места их сбора. Например, первый кластер представлен в основном генотипами Самухского района; преобладающее количество изученных сортов самухов (15 из 16) были объединены в первом кластере. Среди 19 генотипов, включенных во второй кластер, преобладают представители Исмаиллинского района. Все генотипы, сгруппированные в пятом кластере, были собраны из Агсу. Комбинация этих генотипов указывает на наличие сходных аллельных вариантов для большинства изученных интермикроса-теллитных локусов. В исследованиях M. Talebi с сотрудниками при анализе молекулярной вариации ISSR существенной корреляции между географическими регионами и генетической структурой изученных образцов граната не отмечали. При этом значение индекса сходства колебалось в пределах 0,291–0,930 и в среднем было равно 0,674 [24]. В нашем исследовании коэффициент жаккардового сходства варьировался от 0,03 до 1,00 со средним значением 0,77.

Заключение. Настоящее исследование показывает, что разнообразие существует в зародышевой плазме дикого граната, собранной в Азербайджане. С тех пор наблюдалось большое количество генетического разнообразия в растениях, что в дальнейшем привело к легкой адаптации растений к различным условиям окружающей среды. Исследования по молекулярному анализу различных генотипов могут также привести к установлению филогенетических отношений внутри генотипов, принадлежащих к одному или разным местам. Это также поможет понять процесс одомашнивания в ближайшем будущем.