Изучение генетического разнообразия образцов коллекции розы эфиромасличной института сельского хозяйства Крыма с применением ISSR-маркеров

The research was conducted on a base of the collection of an aromatic, essential-oil, and medicinal plants genepool of the Research Institute of Agriculture of Crimea registered in the Russian Federation as a unique scientific attitude UNU No. 507515 .

Введение . Среди ценных сельскохозяйственных культур роза эфиромасличная востребована благодаря широкому применению получаемых из нее продуктов переработки [1; 2]. Отечественное производство продуктов из эфиромасличных роз ориентируется на соблюдение международных стандартов качества, в связи с чем основным приоритетом эфиромасличного розоводства является выведение сортов с улучшенными качествами. С этой целью в селекционной работе Института сельского хозяйства Крыма в качестве одного из основных компонентов гибридизации используют болгарскую Казанлыкскую розу, эфирное масло которой является наиболее востребованным для использования в парфюмерно-косметическом производстве [3].

Геном розы, состоящий из семи хромосом, удобен для изучения благодаря небольшому размеру. При этом он достаточно сложный из-за плоидности (от 2n до 10n), которая обусловливает генетическое разнообразие роз [4]. Исследования по оценке генетического разнообразия сортов являются важной частью селекционной работы. Эти данные могут быть использованы для изучения и сохранения генетических ресурсов предковых форм в комплексе с данными о фенотипическом проявлении признаков при формировании родительских пар для гибридизации, а также для создания генетических паспортов на зарегистрированные и новые сорта и защиты авторских прав. Актуальность этих исследований обусловлена также тем, что в настоящее время в «Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию» России включены пять сортов – Радуга, Лань, Лада, Легрина и Золушка, оригинатором и собственником которых является ФГБУН «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыма» (НИИСХ Крыма) [5; 6; 7].

Изучение генетического разнообразия основывается на анализе полиморфизма ДНК, обусловленного изменениями в нуклеотидной последовательности. Одним из таких подходов является анализ межмикросателлитных последовательностей (ISSR – Inter Simple Sequence Repeats), основанный на методе ПЦР. Преимущества этого анализа: дает четко воспроизводимые и стабильные результаты; является простым и дешевым; обладает мультилокусностью – наличием большого количества продуктов амплификации; для поиска маркеров не требуется знание нуклеотидной последовательности. Недостатком метода является то, что ISSR-маркеры доминантны и не выявляются в случае гетерозиготности организма, а также неизвестны их локализация в геноме и функции. ISSR-метод широко используется для паспортизации растений [8; 9; 10].

Цель работы – изучить генетическое разнообразие образцов коллекции розы эфиромасличной НИИСХ Крыма с использованием ISSR-маркеров.

Материалы и методы. Исследования по изучению генетического разнообразия образцов коллекции розы эфиромасличной проводили в 2022 г. Материалом для исследования служили образцы из коллекции розы эфиромасличной селекционно-семеноводческого центра НИИСХ Крыма [7] (с. Крымская роза, Белогорский район, Республика Крым): сорта НИИСХ Крыма и коллекционный образец Индика, болгарские сорта, а также образец дикой флоры Rosa canina L. из коллекции Ботанического сада имени Н.В. Багрова Крымского федерального университета им. В.И. Вернадского (табл. 1) .

Таблица 1

Образцы роз, использованные для анализа генетического разнообразия

Сорт/вид	Название	Происхождение
	Образцы из Болгарии
Сорта	Белая	Rosa alba L.
	Искра	R. damascena Mill.
	Казанлык-ская	R. damascena Mill.
	Свежен	R. damascena Mill.
	Образцы НИИСХ Крыма
	Аура	R. damascena Mill. × R. gallica L.
	Золушка	Весна ( R. damascеna Mill. × R. gallica subsp . еryosyla Kell. var. аustriaca Grantz f. рanonica Br.)
	Лада	Белая ( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill.) × R. gallica L.
	Лань	Белая ( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill.) × R. gallica L.
	Легрина	Белая ( R. alba L.) × Мичуринка ( R. damascena Mill.) × R. gallica L.
	Радуга	Весна ( R. damascеna Mill. × R. gallica subsp . еryosyla Kell. var. аustriaca Grantz f. рanonica Br.) × Крымская красная ( R. gallica L.)
Образцы дикой флоры
Виды	R. indica Major	Коллекционный образец НИИСХ Крыма
	R. canina L.	Коллекционный образец Ботанического сада им. Н.В. Багрова

Для выделения ДНК из растений был использован СТАВ-метод, описанный в литературе, с модификациями [11]. Количество и качество выделенной ДНК оценивали методом горизонтального электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле и на спектрофотометре SPECTROstar Nano (BMG LABTECH, Германия). ПЦР-смесь общим объемом 20 мкл имела следующий состав: 10 нг ДНК, 2,5 единицы HotStart Taq-полимеразы (Qiagen, Германия), 1-кратный буфер, 0,2 мМ дНТФ (Евроген, Россия), 10 пМ праймера (Евроген, Россия). Амплификация проводилась в термоциклере Т-100 (BIORAD, США) по следующей программе: начальная денатурация 15 мин при 95 °С; 35 циклов: денатурация 30 с при 94 °С, отжиг праймеров 30 с при 48,9–58,0 °С, элонгация 1 мин при 72 °С; терминальная элонгация 10 мин при 72 °С. Продукты ПЦР визуализировали с помощью горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле в 0,5%-ном ТАЕ-буфере с окрашиванием бромистым этидием. Также были определены такие параметры, как PIC, EMR и MI, являющиеся мерами информативности праймера и определяющие его пригодность к использованию [12]. При статистической обработке данных отсутствие полосы приравнивали к 0, а наличие – 1 и составляли бинарную таблицу. На основании данных бинарной таблицы в программе NTSYS-pc 2.1 (Numerical Taxonomy System) [13; 14] была построена матрица генетических дистан-ций/различий между генотипами по Nei [15]. Используя данные матрицы, проводили кластеризацию исследуемых генотипов путем построения филогенетической дендрограммы методом невзвешенной попарной группировки с усреднением (UPGMA) [16].

Результаты и обсуждение. Общее количество использованных праймеров составляло 20, большая часть из которых не дала удовлетворительных результатов. По итогам детекции ПЦР-продуктов было отобрано восемь праймеров, давших наиболее четкую визуализацию продуктов амплификации на электрофореграмме (табл. 2).

Таблица 2

ISSR-праймеры для анализа генетического разнообразия розы эфиромасличной

Название праймера	Нуклеотидная последовательность праймера (5'→3')	Температура отжига, °C	Источник литературы
ISSR-	AGCAGCAGCAGCY	52,0	[17; 18]
ISSR-В10	CAGCAGCAGCAGCAG	52,4	[13; 17]
ISSR-В13	CAACAACAACAACAA	41,9	[13; 17]
ISSR-	AGAGAGAGAGAGAGAGC	58,0	[18; 19; 20]
ISSR-807	AGAGAGAGAGAGAGAGT	52,6	[13; 17; 18; 20; 21]
ISSR-	GAGAGAGAGAGAGAGAA	52,4	[18; 22]
ISSR-834	AGAGAGAGAGAGAGAGYT	56,2	[14; 21; 23; 24; 25]
ISSR-840	GAGAGAGAGAGAGAGAYT	48,9	[14; 26]

Все указанные праймеры дают 100 % значения полиморфизма, что характеризует их способность оценивать генетическое разнообразие в полной мере, а также говорит о генетической гетерогенности исследуемых образцов (табл. 3). Значение PIC приблизительно равно для всех праймеров, при этом величины EMR и MI наиболее высоки для праймеров ISSR-B10, ISSR-834 и ISSR-840, из чего следует, что они являются наиболее эффективными для оценки генетического разнообразия образцов эфиромасличной розы НИИСХ Крыма.

Таблица 3

Информативные параметры праймеров, использованных в работе

Праймер	Количество локусов		% полиморфизма	PIC	EMR	MI
	общее	полиморфных
ISSR-А34	18	18	100	0 23	18	415
ISSR-В10	32	32	100	0 24	32	7 75
ISSR-В13	24	24	100	0,22	24	5,36
ISSR-230/41	25	25	100	0,23	25	5,86
ISSR-807	21	21	100	0,28	21	5,90
ISSR-812	21	21	100	0,22	21	4,69
ISSR-834	26	26	100	0,26	26	6,64
ISSR-840	27	27	100	0,25	27	6,64

При кластерном анализе образцов получены результаты, отражающие степень генетической удаленности образцов в со- ответствии с коэффициентом Nei (рисунок).

----------------------R. canina L.

____          I -------------Аура

1--------------Белая

-- ---------I— Искра I I Казанлыкская

—                    'Свежен

*^----Золушка ---------Лада ---------Лань ----------Легрина

-------------------- Радуга .................— R. indica Major

Рисунок – Дендрограмма кластеризации образцов коллекции розы эфиромасличной

НИИСХ Крыма методом UPGMA по индексу Nei на основании матрицы генетических дистанций

На дендрограмме выделяются 2 группы: в первую группу входят вид R. cani-na L. и сорта Аура, Белая, Искра, Казанлыкская, Свежен и Золушка; ко второй группе относятся сорта Лада, Лань, Легрина и Радуга.

Максимальной генетической близо-стью/сходством обладают сорта Ка-занлыкская и Свежен, выделенные в отдельный подкластер и образующие единый кластер с сортом Искра. Все три сорта происходят от одного предка R. damascena и имеют болгарское происхождение, чем, вероятно, объясняется их близость. Этот кластер объединен в надкластер с сортом Золушка, имеющим крымское происхождение. Это может говорить о том, что сорт Золушка генетически близок к болгарским сортам.

В первой группе также присутствуют объединенные в один кластер, несмотря на разное происхождение, крымский сорт Аура и болгарский сорт Белая. Кластеры Аура/Белая и надкластер Искра/Казанлык-ская/Свежен/Золушка объединены в одну подгруппу, к которой отдельной ветвью примыкает вид R. canina L.

Таким образом, в первой группе присутствуют все болгарские сорта и два крымских сорта.

Во второй группе присутствуют только сорта крымского происхождения. Кластер Лань/Легрина второй по генетической близости после кластера Ис-кра/Казанлыкская/Свежен. Он образует надкластер с сортом Лада. Все три сорта имеют одинаковых предков. Сорт Радуга очень удален генетически от всех сортов, несмотря на то, что имеет одинаковых предков с сортом Золушка. Вид R. indica Major является самым генетически удаленным.

Заключение . Подобраны эффективные ISSR-маркеры для оценки генетического разнообразия образцов коллекции розы эфиромасличной НИИСХ Крыма. Определены максимальные и минимальные генетические расстояния/различия между образцами. Отмечено, что крымские сорта Аура и Золушка попадают в общую группировку с сортами болгарского происхождения, что может говорить о генетической близости отечественных сортов к болгарским.