Изучение генетического родства и разнообразия Vigna L. с использованием маркеров ISSR и RAPD

Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice

УДК 577.20                                        

Вигна початковая, Вигна китайская ( Vigna unguiculata (L.) Walp., 2n = 2x = 22), также известный как Коровий горох, Коровий горох китайский, хорошо приспособлен к тропикам. Он охватывает около 50 тыс га обрабатываемых земель в Индии, Нигерии, Буркина-Фасо, Гане, Кении, Уганде, Малави, Шри-Ланке, Бирме, Бангладеш, Филиппинах, Индонезии, Таиланде и др. Все данные свидетельствуют о том, что вигна родом из Африки. Точный центр цивилизации неизвестен. Предполагаемым центром одомашнивания растения считаются Эфиопия, Центральная и Южная Африка. В Индии вигна известен со времен Вед. По данным Симмондса (1976), Западная Африка и Индия считаются центрами разнообразия этого растения. Однако основным местом происхождения вигны принято считать Африку, поскольку, хотя дикие подвиды этого вида были обнаружены в Африке, в Азии они не встречаются. V. unguiculata имеет более 20 синонимов. Известны 3 культурных и 2 диких подвида вигны: Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis, Dolichos sesquipedalis L., Vigna sesquipedalis (L.) Fuhrw.; Vigna unguiculata subsp. Cylindrica ( L.) Verdc.; Vigna unguiculata ssp. dekindtiana (L.); Vigna unguiculata var. mensensis (Schweinf.) Maréchal, Mascherpa & Stainier.

Первые три из этих подвидов являются культурными, а два других — дикими. Многие ученые не рассматривают эти три подвида как отдельную группу, классифицируя их как V. unguiculata subsp. unguiculata и рассматривает их как межвидовую категорию — культигруппу. Сюда входят 5 групп сортов: Unguiculata, Biflora, Sesquipedalis, Textilis и Melanophthalmus . Представители группы сортов Textilis используются для производства волокна в некоторых регионах Нигерии. Слово «коровий горох» впервые было использовано в Соединенных Штатах в 1798 году [1]. Это название, вероятно, произошло от их использования в качестве корма для коров [2]. Черные бобы отличаются наличием отчетливо видимой черной точки на семени. Susquipedalis в переводе с латыни означает «пол фута». Это растение отличается необычайно длинными стручками. Коровий горох в основном используется в качестве сухого семенного материала, корма для животных, зеленого удобрения и покровной культуры [1, 2].

Хромосомы Вигна, имеющие диплоидный набор хромосом, малы и с ними трудно работать. Начинают применяться передовые цитогенетические методы, такие как флуоресцентное окрашивание хромосом и гибридизация in situ, которые, как ожидается, будут полезны для программ селекции растений в будущем. У вигны (2n=22) имеется 1 короткая (19 µm), 7 средних (26–36 µm) и 3 длинные (41–45 µm) хромосомы. Размер его генома составляет 620 миллионов пар нуклеотидов (нп). Геном вигны был секвенирован в 2019 г с помощью однонуклеотидного секвенирования в реальном времени на платформе PacBio (Pacific Biosciences of California, Inc., Менло-Парк, Калифорния, США). Всего было секвенировано 568 Gb последовательностей и аннотировано 29 773 локуса, кодирующих белки. В геноме коровьего гороха обнаружено 39,2% транспозонных элементов, 4% SSR и 5,7% неидентифицированных повторяющихся последовательностей. Повторяющиеся последовательности в основном сосредоточены в областях центромеры и перицентромеры. Составлен полный список из 159 генов и предложены стандартные символы генов на основе стандартных правил номенклатуры генов, принятых Международным комитетом по расширенным сигналам генов и Кооперативом по генетике [1-3].

Материал и методы исследования

Научно-исследовательские работы проводились в 2017-2018 гг на Абшеронской экспериментальной базе Института генетических ресурсов НАНА в условиях обычного орошения. Посев проводили по методике на глубину 5-7 см, с шириной междурядий 60 см и расстоянием между растениями 5-10 см. В качестве семенного материала были взяты 30 образцов коровьего гороха, полученных из Генбанка Института генетических ресурсов НАНА. Образцы были подвергнуты сравнительному анализу.

^01

VuO6

Рисунок. Геном вигны. а-хромосомы; центромерная часть показана красной полосой

Анализ и обсуждение

Целью исследования была оценка генетического разнообразия и степени родства в коллекции Vigna, а также выявление генетически дивергентных форм для селекции. Известно, что в отличие от специфических праймеров, разработанных для одного растения, неспецифические ISSR- и RAPD-маркеры обладают способностью амплифицировать фрагменты ДНК в разных растениях. Однако информативность этих маркеров, их полиморфизм и возможность получения полезных для анализа профилей различаются в зависимости от изучаемого растения и коллекции.

Молекулярно-генетические исследования были проведены на 30 образцах, принадлежащих к 2 видам рода Vigna L. ( V. unguiculata, V. radiata ). Однако, поскольку четкие линии не были получены для 2 образцов, представляющих вид V. radiata , анализы были продолжены на 28 генотипов V. unguiculata .

Первоначально полимеразная цепная реакция проводилась с 5 праймерами ISSR, с 2 из которых (UBC 810 и UBC 812) не было синтезировано ни одного продукта амплификации для более чем половины образцов, тогда как для остальных 3 образцов были получены ампликоны для большинства образцов грунтовки. С использованием праймеров UBC 810 и UBC 812 было синтезировано 8 (5 полиморфов) и 6 (3 полиморфа) последовательностей длиной 250–900 н.п. (пара нуклидов) соответственно. Другой профиль был получен для образца № 12 AG-342 с маркером UBC 810 с последовательностью (GA)8T.

Igwe D. O. et al. использовали 10 праймеров ISSR для оценки генетического разнообразия в 18 генотипах коровьего гороха, и только 4 из праймеров амплифицировали видимые полосы и использовались для дальнейшего анализа [3].

Используя праймер UBC 818, который амплифицирует последовательности между микросателлитными локусами (CA)8G, было синтезировано 8 последовательностей для 28 образцов коровьего гороха, 6 из которых были полиморфными, что привело к проценту полиморфизма 75% (Таблица 1).

Таблица

ПОКАЗАТЕЛИ, ПОЛУЧЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ ISSR-МАРКЕРОВ

s. 53 50 О Ж ^ ^	s и.	И о о	e st ^ о	o\ s 1	50 О §	tel	b<			c
UBC 818	(CA) 8 G	8	6	75	0.83	0.36	4.5	1.62	3.36	0.56
UBC 835	(AG) 8 YC	13	12	92.3	0.89	0.33	11.07	3.66	5.96	0.50
UBC 857	(AC)8YG	7	4	57	0.69	0.33	2.3	0.76	1.7	0.43
UBC 810	(GA) 8 T	8	5	62.5	0.54
UBC 812	(GA) 8 A	6	3	50	0.50
Среднее		8.4	6	67.4	0.70	0.34	5.94	2.01	3.76	0.50
Общее		42	30

ЕПИ - емкость полиформической информации, КГР - коэффициент генетической разновидности, КЭМ - коэффициент эффективности мультиплекса, ИР - индекс различия, ПД -показатель потенциала дискриминации, СПД - среднее ПД

Информационная емкость полиморфизма (ЕПИ) отражает способность праймера или комбинации праймеров обнаруживать полиморфизм между двумя случайно выбранными генотипами и основана на числе аллелей и распределении их частот. ЕПИ принимает минимальное значение (0) для мономорфных маркеров и максимальное значение (0,5) для маркеров, которые присутствуют в 50% генотипов, но отсутствуют в остальных 50%. В нашем эксперименте коэффициент генетического разнообразия (КГР) и информационная емкость полиморфизма (ЕПИ) для праймера UBC 818 составили 0,827 и 0,36 единиц соответственно, что является достаточно высоким показателем.

Размер синтезированных связей варьировался в диапазоне 250–1500 нп (пара нуклидов).

В результате различных комбинаций полученных линий было выделено 8 различных профилей для 28 генотипов.

Уникальный профиль был зарегистрирован для генотипов AG-342, K-1138 и сорта «Айла».

Вывод

Всего для коллекции коровьего гороха с ISSR-маркерами было синтезировано 28 аллелей со средним индексом полиморфизма 75%. Было обнаружено, что коллекция отличается богатым генетическим разнообразием (KГР=0,80; ЕПИ=0,34). Статистический анализ показал, что эффективность и разрешение праймеров UBC 835 и UBC 818 были высокими.