Изучение генетической архитектуры конверсии корма у хряков (Sus scrofa) породы Дюрок на основе полногеномного анализа SNP

Увеличение продуктивности при снижении затрат кормов относится к главным целям селекции сельскохозяйственных животных (1, 2). Конверсия корма (feed conversion ratio, FCR), рассчитываемая как отношение количества потребленного корма к приросту живой массы, — важнейший показатель, определяющий экономическую эффективность производства свинины, так как затраты на корма достигают 70 % в себестои-

При выполнении исследований использовалось оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. академика Л.К. Эрнста. Исследования выполнены при поддержке Минобрнауки России, уникальный номер проекта RFMEFI60417X0182.

мости свинины (3, 4). Разработка автоматизированных кормовых станций сделала возможным проведение точного индивидуального учета потребления корма при групповом содержании свиней, что стало основой для интеграции показателя FCR в программы селекционно-племенной работы (5-7). Детальный анализ наследуемости конверсии корма, проведенный на трех породах свиней (8), выявил умеренную степень генетической изменчивости между отдельными породами (h2 = 0,30-0,54). Индивидуальные различия свиней по показателю конверсии корма, основанные на генетических факторах, могут служить источником для выявления ДНК маркеров с целью прогнозирования этого показателя и его использования в селекции свиней (9-13).

На основании анализа генетического сцепления микросателлитных маркеров был идентифицирован ряд QTLs для показателя конверсии корма (14). Так, в кроссбредной популяции (мэйшан ½ крупная белая) были выявлены QTLs для FCR на SSC11 и SSC14 (15). В F2 ресурсной популяции (белый дюрок ½ эрхуальская порода) с использованием 183 микросателлитов обнаружены 3 QTLs для FCR на SSC2, SSC7 и SSC9 (16). Исследование ресурсной популяции крупная белая ½ пьетрен с использованием 118 микросателлитных маркеров показало наличие QTLs для FCR на SSC7 (17). Картирование, проведенное в кроссбредной популяции свиней с использованием 88 информативных микросателлитов, выявило наличие QTL для FCR на SSC2, SSC6 и SSC7 (для периода откорма от 90 до 120 кг) и на SSC2, SSC4 и SSC14 (для периода откорма от 60 до 140 кг) (18). Однако большинство QTLs, идентифицированных на основании анализа сцепления, характеризовалось относительно низкой точностью локализации (в интервале более 20 сМ).

Повышение точности картирования QTL и идентификации соответствующих ДНК маркеров стало возможным благодаря созданию ДНК-чипа, позволяющего проводить одновременный анализ десятков тысяч SNPs (Porcine60K BeadChip, «Illumina, Inc.», США). У свиней породы дюрок было установлено наличие регионов, достоверно ассоциированных с FCR, на SSC4, SSC7, SSC8 и SSC14 (19), на SSC4 и SSC15 (20), а также на SSC12 (21). Полногеномные ассоциативные исследования (genome wide association study, GWAS), проведенные в F2 ресурсной популяции, показали присутствие QTL для FCR на SSC7 (22). У терминальных хряков Максгро описаны 12 1-Mb регионов на SSC6, SSC7, SSC9, SSC11, SSC14 и SSC15, ответственных за более 0,5 % генетической изменчивости признака (23). Таким образом, проведенные ранее исследования показали наличие в геноме свиней множественных QTLs, связанных с конверсией корма, при этом участки генома, идентифицированные в разных работах, перекрывались лишь частично. Вовлечение в исследования новых популяций свиней расширяет понимание геномной архитектуры этого важного селекционного признака.

Нами впервые на популяции свиней российской репродукции изучена генетическая обусловленность наследования комплексного селекционно и экономически значимого показателя — конверсии корма с использованием технологии микроматриц. В настоящем сообщении мы представляем результаты полногеномного ассоциативного анализа в одной из российских популяций хряков породы дюрок, фенотипированных индивидуально по показателю конверсии корма и генотипированных по ∼ 70 тыс. однонуклеотидных полиморфизмов на полногеномном уровне. В результате выявлены 30 SNPs, достоверно ассоциированные с показателем конверсии корма, а также позиционные и функциональные гены-кандидаты, продукты которых участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, в гематопоэзе и метаболизме липидов.

Целью нашей работы было изучение генетических факторов, влияющих на эффективность использования корма у хрячков породы дюрок.

Методика . Исследования проводили на базе ООО «СГЦ» (Воронежская область, п. Верхняя Хава) в период с октября 2017 по ноябрь 2018 года на 715 хряках породы дюрок, меченных электронными чипами. У всех животных отбирали пробы ткани (ушной выщип), которые консервировали 96 % спиртом и хранили при - 20 ° С. Средний возраст животных на начало и окончание эксперимента составил соответственно 77,6±0,3 и 156,2±0,4 сут. Хрячки содержались в станках с щелевыми полами группами по 15 гол. (площадь пола 1,30 м²/гол.) при температуре 18 ° С. Животные имели неограниченный доступ к кормам и воде. Индивидуальный учет потребления корма осуществляли с использованием автоматических кормовых станций MLPII-RAP («Schauer Agrotronic AG», Швейцария) и GENSTAR («Cooperl Arc Atlantique», Франция).

Величину FCR рассчитывали для каждого животного как отношение потребленного корма к приросту живой массы за весь период выращивания. Значения по параметрам начальной и конечной живой массы хряков, среднесуточных приростов и продолжительности тестирования на станциях проверялись на соответствие нормальному распределению ( M ±3 σ ). Учитывая различия в продолжительности периода выращивания между группами, неоднородность формирования групп животных по живой массе (как при постановке, так и при снятии с откорма), а также интенсивность приростов, для получения сопоставимых значений конверсии корма использовали уравнение множественной линейной регрессии показателя FCR, рассчитанное в программе STATISTICA 10 («StatSoft, Inc.», США):

FCR ( _r) = 4,6738 - 0,0158x i - 0,0170x 2 + 0,0183x 3 - 0,0024x 4 , где FCR ( _r ) — регрессионное значение конверсии корма; x₁ — продолжительность периода откорма на станции; x₂ — живая масса в начале откорма; x₃ — живая масса в конце откорма; x₄ — величина среднесуточного прироста живой массы за период; 4,6738 — свободный член уравнения, константная величина.

Для выделения ДНК из проб ткани свиней использовали набор ДНК-Экстран 2 (ООО «НПФ Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию двухцепочечной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit 2.0 («Invitrogen/Life Technologies», США). Для определения качества ДНК измеряли соотношение OD₂ 6 ₀/OD₂₈₀ (cпек-трофотометр NanoDrop8000, «ThermoFisher Scientific», США). Для анализа использовали ДНК с OD₂ 6 ₀/OD₂₈₀ = 1,6-1,8. Кроме того, качество ДНК оценивали посредством гель-электрофореза в 1 % агарозном геле.

Полногеномное генотипирование проводили с ДНК-чипом высокой плотности Porcine GGP HD (платформа GeneSeek Genomic Profiler, «Neogene», США), содержащим ~ 70 тыс. SNPs. Контроль качества и фильтрацию данных генотипирования для каждого SNP и каждого образца выполняли с программным пакетом PLINK 1.9 , применяя следующие фильтры (в скобках даны соответствующие команды в программе PLINK): качество генотипирования по всем исследуемым SNPs для индивидуума не ниже 90 % (--mind); качество генотипирования для каждого из исследованных SNPs по всем индивидуумам не ниже 90 % (--geno); частота встречаемости минорных аллелей (MAF) 0,03 (--maf); отклонение SNP генотипов от распределения Харди-Вайнберга в совокупности протестированных образцов с достоверностью p-value < 10-6

(--hwe). После контроля качества для GWAS-анализа отобрали 44810 SNPs.

Для выявления ассоциаций SNP маркеров с показателем FCR применяли регрессионный анализ в PLINK 1.90 (--assoc --adjust --qt-means). Для подтверждения достоверного влияния SNP и определения значимых регионов в геноме свиней использовали тест для проверки нулевых гипотез по Бонферрони при пороговом значении p < 1,12½10-6, 0,05/44810. Данные визуализировали в пакете qqman с помощью языка программирования R (24). Для поиска генов-кандидатов, локализованных в области идентифицированных SNP, использовали геномный ресурс Sscrofa10.2 , дата обращения 02.04.2019). Функциональные аннотации генов выполняли с привлечением базы данных GeneCards , дата обращения 02.04.2019). Расчет средних арифметических (M) и стандартных ошибок средних (±SEM), коэффициента вариации (Cv, %) осуществляли в MS Excel 2013.

Результаты . Начальная и конечная живая масса хрячков, используемых в исследованиях, составила соответственно 35,3±0,2 и 110,5±0,5 кг при среднесуточных приростах за контрольный период 962,0±5,1 г, средняя конверсия корма — 2,53±0,02 кг/кг (табл. 1).

1. Характеристика фенотипических показателей в исследованной выборке хряков ( Sus scrofa ) породы дюрок ( n = 715, ООО «СГЦ», Воронежская обл., п. Верхняя Хава, октябрь 2017-ноябрь 2018 года)

П р и м еч а ни е. ADG, г/сут — среднесуточный прирост; ADFI, г/сут — среднесуточное потребление корма; FCR, кг/кг — конверсия корма; M — среднее значение; SEM — ошибка среднего; Min — минимальное значение, Max — максимальное значение; C_V , % – коэффициент вариации (отношение среднеквадратического отклонения ϭ случайной величины к ее ожидаемому значению).

Результаты GWAS-анализа для показателя конверсии корма в исследованной выборке хряков ( Sus scrofa ) породы дюрок: ось Х — номер хромосомы свиней; ось Y – обращенный десятичный логарифм уровня достоверности -log 10 (p); верхняя горизонтальная линия — порог достоверности для полногеномных ассоциаций, -log 10 (p) = 1,2½10 ^{- 6}; нижняя горизонтальная линия — порог достоверности для суггестивных ассоциаций -log 10 (p) = 1,02½10 ^{- 5}) ( n = 715, ООО «СГЦ», Воронежская обл., п. Верхняя Хава, октябрь 2017-ноябрь 2018 года).

В результате проведенного GWAS-анализа мы идентифицировали 30 SNPs на SSC2, SSC3, SSC4, SSC6, SSC7, SSC12 и SSC15, достоверно ассоциированных с показателем FCR (p < 0,00001), при этом на SSC2, SSC6 и SSC15 были обнаружены блоки из 3-10 SNPs. Для трех SNPs (H3GA0010441, ALGA0119936 на SSC3 и ASGA0028727 на SSC6) достоверность превышала порог для полногеномных исследований (p < 1,2½10 ^{- 6}) (рис., табл. 2).

2 . Достоверно значимые (p < 0,00001) SNPs, ассоциированные с конверсией корма у хряков породы дюрок, и потенциальные гены-кандидаты ( n = 715, ООО «СГЦ», Воронежская обл., п. Верхняя Хава, октябрь 2017-ноябрь 2018 года)

П р и м е ч а н и е. а — SNP с уровнем достоверности, превышающим порог для полногеномных ассоциаций. Указаны позиции в сборке генома Sscrofa10.2 .

Наиболее интересные позиционные и функциональные гены-кандидаты, идентифицированные в непосредственной близости от значимых SNPs, включают гены ABTB2, CAPRIN1 (локализованы на SSC3 внутри блока из 10 SNP-кандидатов в области 29,0-30,9 сМ), RBAK (локализован на SSC3 в непосредственной близости (-10825) от полногеномного SNP ALGA0119936), PTPRU, MECR, MED18, PHACTR4 и RCC1 (локализованы на SSC6 внутри блока из 7 SNP-кандидатов в области 79,1-80,3 сМ). Продукт ABTB2 обладает активностью гетеродимеризации белков, продукт CAPRIN1 участвует в регуляции пролиферации и миграции различных типов клеток. Белок, кодируемый LMO2, играет центральную роль в развитии гематопоэза, кодируемый RBAK — взаимодействует с андрогеновым рецептором, влияющим на пролиферацию и дифференцировку клеток, а также фактором транскрипции E2F, играющим решающую роль в контроле клеточного цикла. PTPRU является сигнальной молекулой, регулирующей широкий спектр клеточных процессов, включая рост, дифференци- ровку, митотический цикл. Среди известных функций MECR — участие в метаболизме и биосинтезе жирных кислот. Продукт MED18 — один из компонентов медиаторного комплекса, вовлечен в регуляцию транскрипции, также установлено его участие в метаболизме липидов. Функции белка, кодируемого PHACTR4, включают участие в пролиферации клеток нервной системы, а также взаимодействие с α-актином скелетных мышц, вовлеченных в моторику у разных типов клеток. У человека установлена связь полиморфизмов в генах CAPRIN1, LMO2, MECR, PTPRU, PHACTR4 и RCC1 с систолическим давлением, в LMO2, PTPRU и ABTB2 — с концентрацией протеинов в крови, в CAPRIN1, LMO2, MED18, PHACTR4 и RBAK — с эритроцитарными характеристиками. Известно, что уровень систолического давления ассоциирован с интенсивностью роста в ювенальный период (25). В свою очередь, установлена связь гематологических параметров с интенсивностью роста свиней (26, 27), коррелирующей, как известно, с конверсией корма (5). Показана связь содержания протеинов (гликопротеина и гаптоглобина) в крови свиней с интенсивностью роста и эффективностью использования корма (28).

Таким образом, проведенные нами полногеномные исследования в популяции хряков породы дюрок выявили наличие 30 SNPs, достоверно ассоциированных с показателем конверсии корма, которые локализованы на SSC2, SSC3, SSC4, SSC6, SSC7, SSC12 и SSC15 (p < 0,00001), при этом на SSC2, SSC6 и SSC15 обнаружены блоки из 3-10 SNPs. Анализ геномных регионов в области локализации достоверных SNPs показал наличие нескольких позиционных и функциональных генов-кандидатов, продукты которых принимают участие в регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток, гематопоэзе, метаболизме липидов. Для валидации обнаруженных ассоциаций в других популяциях свиней необходимы дополнительные исследования. Идентификация QTLs по признаку конверсии корма расширяет наше понимание геномной архитектуры этого важнейшего селекционного признака.