Изучение иммунотерапевтических свойств иммуномодулятора КИМ-М2 на морских свинках, инфицированных нетуберкулезными микобактериями

Введение. В настоящее время, помимо микобактерий туберкулезного комплекса ( Mycobacterium tuberculosis complex – МТВС), описано большое разнообразие нетуберкулезных микобактерий (НТМ) [1, 2]. Многие из них являются условно-патогенными микроорганизмами и могут вызывать у людей и животных лимфадениты, инфекции легких, кожи, мягких тканей, сухожилий, суставов и костей [3, 4]. Частота инфекций, вызванных НТМ, увеличивается по мере улучшения эпидемиологической и эпизоотической обстановки по туберкулезу [5, 6].

Различные виды нетуберкулезных микобактерий в организме животных вызывают перекрестные иммунные реакции, затрудняющие диагностику стандартным тестированием, в частности с помощью кожной аллергической пробы и анализа гамма-интерферона (IFNγ). Причиной этому является использование очищенного туберкулопротеина ППД (PPD – purified protein derivative), содержащего филогенетически гомологичные антигенные детерминанты, общие для нетуберкулезных и туберкулезных микобактерий [7].

В географическом распространении нетуберкулезных видов существуют различия, которые не имеют полного объяснения. Исследователи разных стран мира отмечают, что с большой долей вероятности в процесс аллергической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота вмешиваются M. terrae, M. kansasii, M. szulgai, M. scrofulaceum, M. phlei, M. smegmatis, M. Chelo– nae, M. engbaekii, M. arupense, M. Nonchromo– genicum, M. gordonae, M. fortuitum, M. Intracel– lulare , M. vaccae и др., которые приводят к ложноположительным результатам и значительным экономическим потерям [2, 8–11].

Отсутствие надежных методов прижизненной дифференциации неспецифических реакций, обусловленных нетуберкулезными микобактериями, создает необходимость поиска методов иммунотерапии для профилактики и/или лечения микобактериозов. В этом плане, как отмечается некоторыми исследователями [12], перспективно использование вакцины БЦЖ, индуцирующей перекрестно-реактивный иммунитет к НТМ. Указанными свойствами, по-видимому, также обладает специфический иммуномодулятор КИМ-М2, представляющий собой иммуногенную фракцию, выделенную из вакцины БЦЖ, конъюгированную с полимерной матрицей [13]. Его производственное применение в схеме специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота предотвратило необоснованный убой маточного поголовья из-за отсутствия реагирующих животных на протяжении нескольких лет [14].

Цель исследования - изучить иммунотерапевтические свойства препарата КИМ-М2 на животных, экспериментально сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями.

Материалы и методы. Исследование выполняли на морских свинках линии агути, содержавшихся в условиях специализированного вивария лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом отдела ветеринарии ФГБНУ «Омский аграрный научный центр». Масса животных к началу эксперимента составляла 400-450 г, возраст - 4-5 месяцев.

В эксперименте использовали нетуберкулезные микобактерии M. scrofulaceum (II группа по Раньону), M. smegmatis и M. phlei (IV группа по Раньону) из Биоресурсной коллекции патогенных микроорганизмов отдела ветеринарии ФГБНУ «Омский АНЦ». Брали 14-суточные культуры, выращенные на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена при температуре 37 °С, из них готовили суспензии на физиологическом растворе из расчета 5 мг культуры на 1 мл. Инокуляцию взвеси микобактерий морским свинкам осуществляли в дозе 5 мг/мл подкожно в область паха слева.

Для получения специфического иммуномодулятора культуру вакцинного штамма БЦЖ, выращенную на жидкой синтетической среде Сотона, подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 в течение 30 мин. Полученную взвесь центрифугировали в надосадочной жидкости после ее предварительной инкубации с формалином, определяли содержание белка с помощью красителя бромфенолового синего. Для иммунизации животных использовали конъюгаты, в состав которых входили антигены БЦЖ в комплексе с поливинил-пирролидоном (ПВП) и полиэтиленгликолем (ПЭГ) в соотношении 1:400. Концентрацию белка в антигенном комплексе доводили до 1 мг/мл, затем в препарат добавляли ПВП в количестве 340 мг, ПЭГ - 60 мг и размешивали до полного растворения при комнатной температуре.

Для эксперимента было отобрано 40 морских свинок, из которых сформировали 8 групп. Пять интактных особей (1-я группа) служили негативным контролем, другие 5 - позитивным контролем (2-я группа), которым подкожно вводили M. bovis (шт. 14) в дозе 1 мкг/мл. Животным 3-й группы (n = 5) - подкожно вводили M. phlei в дозе 5 мг;, 4-й группы (n = 5) - подкожно вводили M. phlei в дозе 5 мг, через 14 сут КИМ-М2 в дозе 500 мкг/мл белка; 5-й группы (n = 5) - подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 5 мг; 6-й группы (n = 5) - подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 5 мг, через 14 сут КИМ-М2 в дозе 500 мкг/мл белка; 7-й группы (n = 5) - подкожно вводили M. Smegmatis в дозе 5 мг; 8-й группы (n = 5) -подкожно вводили M. smegmatis в дозе 5 мг, через 14 сут КИМ-М2 в дозе 500 мкг/мл белка.

Морских свинок всех групп до начала эксперимента и на 21-е сут после введения культур подвергали аллергическому исследованию туберкулином очищенным (ППД) для млекопитающих (Курская биофабрика - фирма «БИОК», Россия) в дозе 25 МЕ в объеме 0,1 мл физиологического раствора путем внутрикожного введения в выстриженные участки кожи на левом боку животного.

Для выявления антигена использовали реакцию непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) в соответствии с методическими рекомендациями [15]. C этой целью производили отбор периферической крови морских свинок всех групп на 3-, 7-, 21-, 28- и 42-е сут от начала эксперимента. Забор крови осуществляли из краевой ушной вены с помощью стеклянной пипетки с резиновой головкой и готовили мазки. Компонентами реакции являлись гомологичные иммунные сыворотки, полученные опытным путем. Специфическое свечение получали окрашиванием антиген-антительных комплексов кроличьей люминесци-рующей сывороткой против глобулинов морской свинки (производство института им. Н.Ф. Гамалеи). Учет реакции проводили по четырехкрестной системе со специфическим свечением не менее трех крестов на микроскопе Axiostar Plus (производство CARL ZEIS, Германия).

Обработку цифрового материала проводили с помощью вариационной статистики.

Результаты и их обсуждение. Результаты исследования показали, что на 21-е сут после инфицирования нетуберкулезными микобакте- риями у морских свинок на введение ППД-туберкулина развивается аллергическая реакция (табл. 1). Так, при сенсибилизации M. phlei и M. smegmatis реагировали 100 % особей, тогда как в группе инфицированных M. scrofulaceum кожная припухлость отсутствовала только у одной особи.

Аллергические исследования морских свинок на 21-е сут после сенсибилизации атипичными микобактериями

Таблица 1

Группа животных	Кожная аллергическая реакция на 21-е сутки после заражения, мм
	n	Реагировало на введение ППД-туберкулина	M±m
1-я (негативный контроль)	5	0	–
2-я (позитивный контроль)	5	5	13,8±1,43
3-я ( M. phlei)	5	5	4,4±0,24
4-я ( M. Phlei + КИМ-М2)	5	0	–
5-я ( M. scrofulaceum)	5	4	4,75±0,48
6-я ( M. Scrofulaceum + КИМ-М2)	5	0	–
7-я ( M. smegmatis )	5	5	7,2±0,37
8-я ( M. Smegmatis + КИМ-М2)	5	1	6,0

У животных 4-й, 6-й и 8-й групп, которым на 14-е сут после инокуляции нетуберкулезных микобактерий был введен специфический иммуномодулятор КИМ-М2, состояния повышенной чувствительности замедленного типа (ПЧЗТ) не регистрировали. Исключением являлась одна морская свинка, инфицированная M. smegmatis (8-я группа). Следует отметить, что заражение этим видом нетуберкулезных микобактерий индуцировало самую высокую сенсибилизирующую способность, о чем свидетельствовала наиболее интенсивная аллерги- ческая реакция у животных 7-й группы, развивающаяся на введение ППД-туберкулина – 7,2±0,37 мм.

Результаты аллергических исследований подтверждались реакцией непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Так, в мазках крови морских свинок всех опытных групп на 3-и и 7-е сут после сенсибилизации нетуберкулезными микобактериями регистрировали антиген с помощью гомологичных сывороток, полученных от зараженных животных (табл. 2).

Таблица 2

Диагностические исследования мазков крови иммунофлуоресцентным методом у морских свинок контрольных и опытных групп, %

Штамм	Сенсибилизированные нетуберкулезными микобактериями (n = 5)				Сенсибилизированные нетуберкулезными микобактериями за 14 сут до введения КИМ-М2 (n = 5)
	Срок исследований, сут
	3, 7	21	28	42	21	28	42
M. phlei	100*	100	0	0	40	0	0
M. scrofulaceum	100*	100	20	20	0	0	0
M. smegmatis	100*	100	100	60	60	0	0
Контроль негативный	0	0	0	0	0	0	0
Контроль позитивный	100	100	100	100	н/и	н/и	н/и

Примечание : (*) – исследованию подвергнуто 10 морских свинок; н/и – не исследовали.

На 21-е сут после инокуляции инфекта положительный результат РНИФ был зафиксирован в группах животных, которые не подвергались обработке КИМ-М2. Несмотря на отсутствие кожной припухлости на введение аллергена, у 3 особей (60 %), инфицированных M. smegmatis , в т. ч. у одной, имевшей, как уже было отмечено выше, положительную аллергическую реакцию на введение ППД-туберкулина, а также у двух (40 %), сенсибилизированных M. phlei , в мазках выявлено специфическое свечение.

У морских свинок, не иммунизированных КИМ-М2, позитивный результат РНИФ на 28-е сут после введения M. smegmatis сохранялся у 100 % особей, M. scrofulaceum – у 20 % и отсутствовал у инфицированных M. phlei . В то же время у всех животных, подвергнутых обработке иммуномодулятором, микобактериозный антиген в мазках крови не был выявлен. Аналогичная картина наблюдалась и на 42-е сут, лишь с той разницей, что только 60 % особей, сенсибилизированных M. smegmatis , имели положительную РНИФ.

Введение иммуномодулятора КИМ-М2, как было отмечено в ранее проведенных исследованиях [14], активизирует фагоцитарные клетки, в частности усиливает окислительно-восстановительный метаболизм по результатам оценки в тесте с нитросиним тетразолием, хотя механизм этого влияния, по-видимому, также связан и со стимуляцией хемотаксического ответа фагоцитов, что в конечном итоге способствует ускоренной элиминации бактерий из организма.

Следует отметить, что вероятной причиной более продолжительных сроков обнаружения M. smegmatis в крови может являться устойчивость этого микроорганизма к фагоцитозу. В частности H.A. Parker и др. (2021) отмечают, что при поглощении нейтрофилами во внутриклеточные фагосомы она значительно медленнее погибала по сравнению с другими бактериями, благодаря своей способности противостоять бактерицидной активности хлорноватистой кислоты (HOCI), продуцируемой в нейтрофильных фагосомах [16].

Заключение. Экспериментальное инфицирование морских свинок нетуберкулезными микобактериями разных видов индуцировало развитие специфической повышенной чувствительности, наиболее выраженное при введении

M. smegmatis . Подкожное введение иммуномодулятора КИМ-М2 на 14-е сут после сенсибилизации способствует устранению кожной ПЧЗТ на введение ППД-туберкулина на 7-е сут после иммунизации.

Контроль за инфекционным статусом животных можно с достаточно высокой эффективностью осуществлять реакцией непрямой иммунофлуоресценции, позволяющей произвести прямое определение наличия микобактерий в крови. С помощью РНИФ антиген в мазках крови регистрировали у 100 % морских свинок, сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями, на 3–21-е сут от начала эксперимента и в последующем преимущественно у инфицированных M. smegmatis , тогда как обработка иммуномодулятором КИМ-М2 способствовала ускоренной элиминации микобактерий из организма животных.