Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия комплексного гепатопротекторного препарата в экспериментах на белых крысах

Сегодня рынок насыщен большим ассортиментом фармакологических препаратов, которые проходят обязательную процедуру оценки отдаленных последствий для прогнозирования их возможной токсичности [2, 3]. Одним из важных условий в токсикологической оценке является учет эмбриотоксической, тератогенной активности новых фармакологических средств и особенно препаратов длительного применения, а именно: кормовых добавок, стимулляторов продуктивности и др. [1, 4].

На основании закона РФ под № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» для получения данных, необходимых для установления реального риска проведения клинических исследований для каждого лекарственного средства должны быть выполнены токсикологические исследования в объеме, указанном в «Методических рекомендациях по изучению репродуктивной токсичности лекарственных средств» [5, 6].

Целью настоящего исследования стало исследование эмбриотоксического и тератогенного действия кормовой добавки «Гепатопротект» на белых крысах.

Материал и методы исследований. Опыты ставились на самках белых крыс с массой тела 200-240 г. Возраст самок – не менее 8 недель. Количество животных в каждой группе 20. Адаптационный период перед экспериментом составил 14 дней, во время которого проводили внешний осмотр и клиническое состояние крыс. Группы формировались методом случайного отбора с использованием массы тела в качестве ведущего признака (разброс по исходной массе между и внутри групп не превышал ± 10 %).

Для изучения эмбрио- и тератогенного действия кормовой добавки «Гепатопротект», регистрируемого в антенатальном периоде и постнатальном периоде развития крыс, было сформировано три группы животных (две опытные и контрольная) (Таблица 1).

Внутрижелудочное введение кормовой добавки «Гепатопротект» животным опытных групп производили в дозах 250 мг/кг (группа № 1) и 500 мг/кг (группа № 2) массы тела, ежедневно, с 1 по 19 сутки беременности. Контрольная (группа № 3) – получала дистиллированную воду, используемую для введения объекта исследования.

Клинический осмотр и установления признаков токсичности проводили ежедневно в течение периода введения.

Масса тела регистрировалась перед началом периода введения кормовой добавки, затем на 7, 14 и 19 сутки беременности.

Показатели эмбриотоксичности. На 20 сутки беременности была проведена некропсия половины животных. При некропсии оценивали количество, массу живых плодов, число особей разного пола, количество желтых тел в яичниках и мест имплантации. Предимплантационную гибель (%) высчитывали по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке; постимлантационную гибель (%) поразности между количеством мест имплантаций и количеством живых плодов.

Оценку тератогенного эффекта производили на основании внешнего осмотра плодов на наличие аномалий, а также измеряли их массу и кранио-каудальный размер. Плоды разделяли на две подгруппы, проводили исследования состояния внутренних органов (для первой подгруппы, по методу Вильсона) и скелета (для второй подгруппы, по методу Доусона).

Таблица 1 – Схема исследования

Номер группы	Вводимое вещество	Доза	Количество и пол животных	Объем введения, мл
Группа № 1	Кормовая добавка «Гепатопротект»	250 мг/кг	20♀	Не более 5 мл
Группа № 2	Кормовая добавка «Гепатопротект»	500 мг/кг	20♀	Не более 5 мл
Группа № 3 (контрольная)	Дистиллированная вода	5 мл	20♀	Не более 5 мл

Для изучения антенатального действия объекта исследования, регистрируемого в постнатальном периоде развития крыс, использовали оставшуюся часть крыс. За двое суток до родов беременных самок рассаживали отдельно по клеткам. После рождения проведена оценка постнатального развития крысят в динамике, состоящая из взвешивания массы тела, времени отлипания ушных раковин, прозрения, опушения, опущения семенников/раскрытия влагалища, появления резцов, и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов.

Для всех количественных вычисляли групповое среднее арифметическое (М), ошибку среднего значения (m). Статистическую обработку данных выполняли с использованием критерия t-Стъюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.

Результат исследований . Данные по изучению прироста массы тела беременных самок, приведены на рисунке 1.

Рисунок 1 – График прироста живой массы белых самок-крыс с 1-го по 19-е сутки эксперимента, г

На основании полученных данных можно констатировать, что кормовая добавка «Гепатопротект» не вызывает вредного влияния и гибели крыс-самок в опытных группах. Достоверных различий в динамике прироста массы тела беременных самок опытных и контрольной групп также не было выявлено.

Результаты исследования эмбриотоксического действия кормовой добавки «Гепатопротект» в опытных и контрольной группах приведены в таблицах 2 и 3.

Таблица 2 – Изучение эмбриотоксического действия кормовой добавки «Гепатопротект» на белых нелинейных крысах при внутрижелудочном введении с 1-го по 19-е сут беременности

Показатель	Группа
	1	2	3 (контроль)
Количество беременных самок	10	10	10
Количество живых плодов, всего/среднее	116/11,6±0,59	122/12,2±0,49	126,0/12,6±0,59
Средний вес эмбрионов, г	2,54±0,12	2,33±0,15	2,38±0,19
Кранио-каудальный размер плодов, мм	28,7±0,06	28,6±0,08	28,2±0,08
Количество желтых тел, всего/среднее	125/12,5±0,55	128/12,8±0,56	136/13,6±0,48
Количество мест имплантации, всего/среднее	120/12,0±0,63	123/12,3±0,47	130/13,0±0,42
Количество мест резорбции, всего/среднее	4/0,4±0,17	1/0,1±0,11	4/0,4±0,17
Предимплантационная смертность, %	4,2±1,49	3,58±1,69	4,2±1,95
Постимплантационная смертность, %	3,17±1,38	0,83±0,88	2,51±1,35
Общая эмбриональная смертность, %	7,24±1,99	4,41±1,70	7,22±2,98
Внешний осмотр плодов
Количество исследованных плодов	116	122	126
Наличие аномалий развития	нет	нет	нет
Количество исследованных плодов
Положение внутренних органов	58	67	69
Наличие аномалий развития	нет	нет	нет
Состояние костного скелета
Количество исследованных плодов	58	55	57
Наличие аномалий развития	нет	нет	нет

Достоверные отличия между опытными и контрольными данными при 95 % уровне вероятности отсутствуют.

На основании данных приведенных в таблице 2 можно утверждать, что внутрижелудочное введение кормовой добавки самкам белых крыс в течение всего срока беременности в дозах 250 мг/кг и 500 мг/кг не вызывало увеличения пред- и постимплантационной смертности, отставания в росте и развитии плода. Органные нарушения (метод Вильсона) и аномалий скелета (метод Даусона) у эмбрионов также не было выявлено.

Данные полученные в результате исследований свидетельствуют об отсутствии у кормовой добавки «Гепатопротект» при его внутрижелудочном введении в дозах 250 мг/кг и 500 мг/кг массы тела с 1 по 19 сут. беременности эмбриотоксического и тератогенного действия, регистрируемого в антенатальном периоде развития.

Отличий в достоверности динамики прироста массы тела беременных крыс в изучаемых группах в постнатальном периоде не установлено (Таблица 3). Достоверные отличия между опытными и контрольными данными при 95 % уровне вероятности отсутствуют. Патологии в течение беременности и родов в подопытных группах не было отмечено. Достоверных отличий по среднему показателю количества плодов на одну самку и соотношение крысят по полу в подопытных группах не установлено.

Данные исследования прироста массы тела и физического развития потомства приведены в таблице 4. Достоверные отличия между опытными и контрольными данными при 95 % уровне вероятности отсутствуют. Введение кормовой добавки не оказывало влияние на физическое развитие потомства.

Таблица 3 – Влияние кормовой добавки «Гепатопротект» на массу тела на белых нелинейных самок – крыс при внутрижелудочном введении с 1-го по 19-е сут беременности

Срок исследования	Группа / масса тела, г
	1	2	3 (Контрольная)
1-е сут беременности	204,70±3,36	209,40±3,69	214,30±1,99
7-е сут беременности	234,40±3,06	242,60±2,56	253,60±4,23
14-е сут беременности	271,80±4,64	276,60±4,78	281,20±2,47
19-е сут беременности	314,30±4,57	323,30±5,51	322,80±3,14
Прирост массы	109,60±3,05	113,90±4,07	108,50±2,75

Таблица 4 – Динамика прироста массы тела и физическое развитие потомства от белых нелинейных крыс, подвергшихся внутрижелудочному введению кормовой добавки «Гепатопротект» с 1-го по 19-е сут беременности

Показатель	Группа
	1	2	3 (Контрольная )
Количество пометов	10	10	10
Количество крысят, всего / ср. в помете	117/11,7±0,59	119/11,9±0,53	112/11,2±0,31
Масса тела на 3 сут, г	8,25±0,15	7,93±0,16	8,15±0,17
Масса тела на 5 сут, г	10,59±0,15	12,17±0,45	12,38±0,33
Масса тела на 13 сут, г	20,4±0,8	22,24±0,78	24,15±1,09
Масса тела на 21 сут, г	35,64±1,9	37,69±2,06	40,47±2,19
Масса тела на 28 сут, г	64,83±2,2	67,79±1,99	70,21±2,57
Отлипание ушной раковины, сут.	3,92±0,11	3,70±0,10	3,72±0,13
Появление первичного волосяного покрова, сут.	4,6±0,08	4,2±0,06	4,3±0,05
Открытие глаз, дни	13,23±0,13	12,8±0,1	13,15±0,11
Прорезывание резцов, дни	8,5±0,06	8,4±0,07	8,46±0,05
Опущение семенников, сут.	26,79±0,25	26,5±0,3	26,91±0,21
Открытие влагалища, сут.	33,8±0,4	33,15±0,17	33,1±0,14
Гибель самок в период вскармливания	0,0	0,0	0,0

Таблица 5 – Скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов потомства от белых нелинейных крыс, подвергшихся внутрижелудочному введению кормовой добавки «Гепатопротект» с 1-го по 19-е сут беременности

Показатель	Группа
	1	2	3 (Контрольная)
Среднее количество крысят в группе	6	6	6
«Переворачивание на плоскости»
День формирования, сут.	4,52±0,06   \	4,42±0,07         1	4,49±0,08
«Отрицательный геотаксис»
День формирования, сут.	5,90±0,06	5,91±0,05	5,92±0,07
1	2	3	4
«Избегание обрыва»
День формирования, сут.        \	6,56±0,09   \	6,44±0,06         1	6,32±0,05
«Мышечная сила»
День формирования, сут.        \	15,19±0,06  \	15,25±0,07        1	15,26±0,06

Процент мертворождения, сроки отлипания ушной раковины, появление первичного волосяного покрова, прорезывания резцов, открытия глаз, опускания семенников и открытия влагалища в группах, получавших кормовую добавку «Гепатопротект» в дозах 250 мг/кг и 500 мг/кг массы тела, достоверно не отличалось от биологического контроля. Снижения массы тела крысят на 3-й, 5-й, 13-й, 21-й и 28-й сутки после родов в опытных группах по сравнению с контрольной группой отмечено не было.

Данные исследований скорости созревания сенсорно-двигательных рефлексов потомства крыс приведены в таблице 5.

Достоверные отличия между опытными и контрольными данными при 95% уровне вероятности отсутствуют.

Изучение времени созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания не установило различий среди потомства: рефлекс переворачивания на плоскости был закреплен у крысят на 5-й день, отрицательный геотаксис — на 6-й, избегание обрыва – на 7-й и мышечная сила на 16 день после родов (Таблица 5).

Заключение. В результате внутрижелудочного введения кормовой добавки «Гепатопротект» в исследуемых дозах (250 мг/кг и 500 мг/кг) беременным белым крысам не установлено отрицательное действие данного препарата на число живых плодов и мест имплантации, а также не выявлено увеличение мест резорбции и гибели эмбрионов до – и после имплантации. Кормовая добавка «Гепатопротект» не оказывала вредного влияния на развитие анатомического строения плодов самок белых крыс (костных и хрящевых закладок в скелете), не вызывала аномалий развития внутренних органов и задержек окостенения костей у плодов.

Кормовая добавка «Гепатопротект» способствовала нормальному физиологическому развитию потомства белых крыс. На основании полученных данных можно утверждать, что у кормовой добавки «Гепатопротект» в дозах 250 мг/кг и 500 мг/кг при внутрижелудочном введении с 1 по 19 сут беременности отсутствует эмбрио- и тератогенное действие в антенатальном и в постнатальном периоде развития.