Изучение комплексообразующей способности глицилглицина с 3D-биогенными металлами

Известно, что комплексные соли α -аминокислот биогенных металлов характеризуются высокой биологической доступностью и нашли применение в медицинской и ветеринарной практике [1, 2].

В последние годы активно развивается медицинская микроэлементология, фармакология физиологически активных пептидов. Пептидные препараты, по сравнению с непептидными, обладают следующими преимуществами: высокая активность в силу близости к эндогенным лигандам; отсутствие токсичности благодаря метаболизму до эндогенных аминокислот; отсутствие грубых побочных эффектов, благодаря регуляторному характеру действия и другие. В НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН проводятся фундаментальные исследования по созданию дипептидных лекарственных препаратов [3].

С целью разработки эффективных лекарственных средств нами проведены экспериментальные исследования комплексообразующей способности глицилглицина с 3 d -биогенными металлами.

Глицилглицин, простейший дипептид глицина, содержит три функциональные группы: амино-, карбоксильную и пептидную, которые способны принимать участие в комплексообразовании.

Аналогия в строении глицилглицина и аминокислоты глицина определяет биологические свойства дипептида.

Известно, что глицин является нейромедиатором тормозного типа действия. В медицине глицин применяют в комплексной терапии мозгового кровообращения [1]. Глицинаты 3 d -биогенных металлов (марганца, железа, цинка, меди) [4, 5] и комплексонаты кобальта (II) [2] обладают высокой биологической активностью. В связи с этим нами проведены исследования по синтезу аналогичных комплексных соединений марганца, железа, кобальта, цинка, меди с глицилглицином.

• 1.    Данные анализов комплексных солей глицилглицина

  №	Брутто формула	Название соединения (дигидратов)	Выход %	Содержание N%		Цвет	Т.пл. ° С	Раство римость в Н 2 О	Качественные реакции
  				Найдено	Вычис лено
  1	[C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Mn ∙2H 2 O	Глицилглицинат марганца	95,0	7,82	7,93	белый с розовым оттенком	186 (н. разл.)	х.р.	FeCl 3 , CuSO 4 + Ац.Na(NH 2 –гр) NaOH (Mn2+)
  2	[C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Fe ∙ 2H 2 O	Глицилглицинат железа (II)	98,0	7,65	7,80	Темнокоричневый	206 (н. разл.)	х.р.	K 3 [Fe(CN) 6 ] – (Fe2+) NaOH (Fe2+)
  3	[C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Co ∙ 2H 2 O	Глицилглицинат кобальта (II)	97,72	7,09	7,20	Темновишневый	190 (н. разл.)	х.р.	CuSO 4 + Ац.Na(NH 2 –гр) NaOH + CuSO 4 (– CO –NH-гр.)
  4	[C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Zn ∙ 2H 2 O	Глицилглицинат цинка	94,50	7,56	7,70	белый	198 (н. разл.)	н.р.	FeCl 3 , CuSO 4 + Ац.Na(NH 2 –гр) NaOH (Zn2+) K 3 [Fe(CN) 6 ] – (Zn2+) NaOH + CuSO 4 (– CO – NH-гр.)
  5	[C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Сu ∙ 2H 2 O	Глицилглицинат меди (II) (хелатный комплекс)	96,60	7,60	7,70	голубой	196 (н. разл.)	х.р.	NaOH + CuSO 4 (– CO –NH –гр.) K 4 [Fe(CN) 6 ] – (Сu2+)
  6	[C 4 H 7 O 3 N 2 Cu] 2 ∙ 2H 2 O	Ди-(глицилглицинат) дикупрат	93,75	6,48	6,60	Темнофиолетовый	205 (н. разл.)	тр.р.	K 4 [Fe(CN) 6 ] – (Сu2+)

В доступной литературе отсутствуют данные о получении комплексонатов глицилглицина 3 d -биогенных металлов. Имеются сведения о расчете стандартных термодинамических характеристик комплексообразования глицилглицина с ионами меди (II), ионами цинка (II), кобальта (II) [6].

Материалы и методы. Для изучения реакции взаимодействия глицилглицина с 3 d -биогенными металлами были использованы следующие реактивы: глицилглицин (дипептид), содержание основного вещества 99,8 %, производства «ACROS Organics» (Бельгия); сульфаты: MnSO 4 ∙ 5H 2 O; FeSO 4 ∙ 7H 2 O; CuSO 4 ∙5H 2 O; ZnSO 4 ∙7H 2 O и CoCl 2 ∙ 6H 2 O, гидроксид натрия марки «х.ч.».

Данные анализов препаратов приведены в таблице 1.

• 1.    Синтез глицилглицината марганца (II). Раствор 1,83 г (0,0076 моль) сульфата марганца (II), MnSO 4 ∙ 5H 2 O в 18 мл воды (рН 3) нагревают до 45-50 ° С в течение 20 минут. К гомогенному раствору (рН 2) присыпают порциями 2 г (0,0152 моль) глицилглицина, нагревают 30-35 минут до 45-50 ° С (рН реакционного раствора 6,5), выдерживают в течение двух часов при комнатной температуре и упаривают. Вязкую массу охлаждают, промывают спиртом, кристаллизуют и сушат при комнатной температуре. Получают 2,5 г (95,0%) глицилглицината марганца (II) дигидрата, [C₄H₇O₃N₂]₂Mn ∙2H₂O.

• 2.    Синтез глицилглицината железа (II). Раствор 2,1 г (0,0076 моль) сульфата железа (II), FeSO 4 • 7H 2 O в 20 мл воды (рН 3) нагревают до 50 ° С в течение 20 минут. К гомогенному раствору (рН 2) присыпают по частям 2 г (0,0152 моль) глицилглицина, нагревают реакционную смесь желтого цвета 30 минут до 45 ° С (рН 6,5), выдерживают в течение двух часов при комнатной температуре, фильтруют и упаривают. Вязкую массу промывают спиртом, кристаллизуют и сушат. Получают 2,35 г (98,0%) глицилглицината железа (II) дигидрата, [C₄H₇O₃N₂]₂Fe ∙2H₂O.

• 3.    Синтез глицилглицината кобальта (II). К раствору 1 г (0,0076 моль) глицилглицина в 10 мл воды прибавляют 0,3 г (0,0076 моль) гидроксида натрия. Наблюдается разогрев реакционной массы до 35 ° С. Гомогенный раствор нагревают до 50-55 ° С и присыпают 0,9 г (0,0038 моль) хлорида кобальта (II), СоСl 2 6H 2 O. Реакционную смесь

• 4.    Синтез глицилглицината цинка. К раствору 2 г (0,0152 моль) глицилглицина в 20 мл воды прибавляют 0,6 г (0,0152 моль) гидроксида натрия. Наблюдается разогрев реакционной массы до 36 ° С. Гомогенный раствор нагревают до 55-60 ° С и присыпают по частям 2,1 г (0,0076 моль) сульфата цинка, ZnSO₄ 7H₂O. Через 5-7 минут выпадает белый осадок. Реакционную смесь выдерживают 30 минут при 55 ° С, в течение одного часа при комнатной температуре и охлаждают. Осадок фильтруют, промывают водой (качественный контроль на сульфаты с BaCl₂), спиртом и сушат при комнатной температуре. Получают 2,6 г (94,50%) глицилглицината цинка дигидрата, [C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Zn ∙2H 2 O.

• 5.    Синтез медных комплексов глицилглицината.

  • 5.1.    Синтез хелатного комплекса глицилглицината меди (II).

Глицилглицинат марганца (II) дигидрат - кристаллический продукт с розоватым оттенком, хорошо растворяется в воде, не растворяется в спирте, ацетоне. При температуре 186 ° С наблюдается начало разложения.

Глицилглицинат железа (II) дигидрат - кристаллический продукт темно-коричневого цвета. Препарат хорошо растворяется в воде (водный раствор светложелтый), не растворяется в спирте, ацетоне. При температуре 206 ° С наблюдается начало разложения.

выдерживают 15 минут при 55 ° С и в течение трех часов при комнатной температуре, а затем фильтруют и упаривают. Остаток промывают спиртом, кристаллизуют и сушат при комнатной температуре. Получают 1,29 г (97,72%) глицилглицината кобальта (II) дигидрата, [C₄H₇O₃N₂]₂Co ∙2H 2 O.

Глицилглицинат кобальта (II) дигидрат - ристаллический продукт темно-вишневого цвета, хорошо растворяется в воде, не растворяется в спирте, ацетоне. При температуре 190 ° С наблюдается начало разложения.

Глицилглицинат цинка дигидрат - кристаллический продукт белого цвета, в воде, спирте, ацетоне не растворяется. При температуре 198 ° С наблюдается начало разложения.

• а)    в слабокислой среде (рН 5-6). К раствору 1 г (0,0076 моль) глицилглицина в 10 мл воды прибавляют 1 г (0,038 моль) сульфата меди (II), CuSO 4 ∙5H 2 O, 0,3 г (0,00365 моль) ацетата натрия и выдерживают в течение двух часов при комнатной температуре. Гомогенный раствор (рН 5-6) ярко синего цвета упаривают, кристаллический продукт промывают спиртом и сушат при комнатной температуре. Получают 1,32 г (96,60%) хелатного комплекса глицилглицината меди (II) дигидрата, [C₄H₇O₃N₂]₂Cu∙2H₂O. Хелатный комплекс глицилглицината меди (II) дигидрат кристаллический продукт ярко голубого цвета, хорошо растворяется в воде, не растворяется в спирте, ацетоне.

При температуре 196 ° С наблюдается начало разложения.

• б)    в щелочной среде (рН 8). К раствору 2 г (0,0152 моль) глицилглицина в 15 мл воды прибавляют 0,61 г (0,0152 моль) гидроксида натрия. Наблюдается разогрев реакционной массы до 35 ° С, выдерживают 10 минут и нагревают до 50 ° С. К гомогенному раствору (рН 8) присыпают 1,9 г (0,0076 моль) сульфата меди (II), CuSO₄ ∙5H₂O и нагревают 25 минут при 55 ° С. Реакционную смесь охлаждают, выдерживают в течение двух

• 5.2.    Синтез двойного комплекса глицилглицината меди (II).

часов при комнатной температуре и упаривают. Кристаллический продукт промывают спиртом и сушат при комнатной температуре. Получают 2,6 г (96,0%) хелатного комплекса глицилглицината меди (II) дигидрата, [C 4 H 7 O 3 N 2 ] 2 Cu ∙2H 2 O.

Хелатный комплекс глицилглицинат меди (II) дигидрат -кристаллический продукт голубого цвета с фиолетовым оттенком. Продукт хорошо растворяется в воде, не растворяется в спирте, ацетоне. При температуре 199 ° С наблюдается начало разложения.

• а)    К раствору 2 г (0,0152 моль) глицилглицина в 15 мл воды прибавляют 1 г (0,025 моль) гидроксида натрия. Наблюдается разогрев реакционной массы до 38 ° С, выдерживают 10 минут и нагревают до 55 ° С. К гомогенному раствору (рН 10) присыпают по частям 1,9 г (0,0076 моль) сульфата меди (II), CuSO 4 ^5^О и нагревают 30 минут при 55-60 ° С. Реакционную смесь охлаждают, выдерживают в течение двух часов при комнатной температуре и упаривают. Кристаллический продукт промывают спиртом и сушат при комнатной температуре. Получают 3,0 г (93,75%) двойного комплекса глицилглицината меди (II) дигидрата, [C₄H₆O₃N₂Cu]₂ ∙2H₂O. Двойной комплекс глицилглицината меди (II) дигидрат - кристаллический продукт темнофиолетового цвета, с трудом растворяется в воде при комнатной температуре, не растворяется в спирте, ацетоне. При температуре 205 ° С наблюдается начало разложения.

• б)    К раствору 1 г (0,0027 моль) хелатного комплекса в 10 мл воды прибавляют 0,3 г (0,0075 моль) гидроксида натрия. Наблюдается разогрев реакционной массы до 32 ° С, выдерживают 10 минут и нагревают до 50 ° С. К гомогенному раствору (рН 10) присыпают 0,35 г (0,00135 моль) сульфата меди, CUSO 4 ^5H 2 O и нагревают 20 минут при 50 ° С. Реакционную смесь охлаждают, выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре и упаривают. Кристаллический продукт промывают спиртом и сушат при комнатной температуре. Получают 1,1 г (94%) двойного комплекса глицилглицината меди (II) дигидрата, кристаллического продукта темнофиолетового цвета.

Результаты исследований. Ранее [4] нами сообщалось о разработке способа получения комплексных солей марганца (II) и железа (II) с глицином. Сущность способа заключается в следующем: первоначально проводят гидролиз сульфатов металлов в водной среде (рН 2-3), а затем прибавляютсубстрат. В процессе гидролиза образуются гидроксид марганца (II), Mn(OH) 2 и гидроксид железа (II), Fe(OH) 2 , соответственно. Гидроксиды Me (II) хорошо растворимы в кислой среде и не подвергаются быстрому окислению, в щелочной среде – нерастворимы и быстро окисляются до гидроксидов металлов (III).

Глицилглицинаты марганца (II) и железа (II) получают по аналогичной методике действием на водный гидролизат сульфатов Mn (II), железа (II), соответственно, глицилглицином. Реакция протекает в гомогенной фазе в кислой среде. При температуре реакции 45-50 ° С, времени 30-35 минут целевые продукты получаются с выходами более 90%.

Схема реакции:

t oC

MeSO + 2HOH     Me(OH) + H SO

2NH CH C N CH COOH +

^{2      2              2}                            рН < 7

ОН

[NH CH C N CH COO ] Ме ( H 2 O)        ^{2       2                2          2}

ОН

(1, 2) где Ме: Мn²⁺(1); Fe²⁺ (2).

Глицилглицинаты Mn (II), Fe (II) представляют собой высокоплавкие кристаллические вещества хорошо растворимые в воде, нерастворимые в спирте.

Глицилглицинаты кобальта (II) и цинка получают действием на гомогенную реакционную смесь глицилглицина и гидроксида натрия в водной среде хлоридом кобальта (II) и сульфатом цинка, соответственно (присыпание кристаллических реагентов). Установлено, что применение в реакции водных растворов реагентов снижает выход и качество препаратов, так как реагенты (неорганические соли) легко гидролизуются с образованием труднорастворимых гидроксидов и легко окисляемого

Со(ОН) 2 . В оптимальных условиях, температура реакции 55-60 ° С, время 20 минут, слабощелочная среда, целевые продукты получают с выходами более 90%.

Схема реакции:

+ ZnSO

( _ Na SO

CoCl

( _ 2NaCl)

рН > 7

2NH CH C N CH COONa

22     2

ОН

[NH CH C N COO ] Ме 22       2

ОН

(3, 4)

где Ме: Со2+(3); Zn2+ (4).

Из данных эксперимента следует, что комплексообразование глицилглицина с ионами металлов не идет по пептидной группе, а идет по амино- и карбоксильной группам (с ионами Mn2+, Fe2+ в слабокислой среде, с ионами Со2+, Zn2+ в слабощелочной среде).

Для подтверждения структуры полученных комплексных солей глицилглигина (1-4) проведены качественные реакции. Соли (1, 4) дают качественную реакцию на аминогруппу с хлоридом железа (III) – хелат красного цвета, с сульфатом меди c добавлением ацетата натрия – ярко синего цвета. Соль кобальта (3), имеющая темновишневый цвет, с сульфатом меди в водном растворе окрашивается в ярко синий цвет. В сильнощелочной среде на пептидную группу качественную реакцию дают соли кобальта (3) и цинка (4) (фиолетовое окрашивание). В этих условиях соль марганца (1) и соль железа (2) образуют осадки Mn(OH)2 и Fe(OH)2.

С K₃[Fe(CN)₆] глицилглицинат железа (II) (2) образует темно-синий осадок турнбулевой сини Fe 3 [Fe(CN) 6 ] 2 , а глицилглицинат цинка (4) – темно-желтый осадок Zn 3 [Fe(CN) 6 ] 2 .

Комплексообразование по функциональным группам глицилглицина с ионами Сu²⁺ протекает в зависимости от условий реакции. В слабокислой 2+ (рН 5-6) и слабощелочной (рН 8) средах глицилглицин с ионами Сu образует хелатный комплекс (с выходами более 90%) по амино-и карбоксильной группам – [NH 2 – CH 2 – CO – NH – CH 2 COO –] 2 Cu (5).

При рН 8 глицилглицинат меди (II) получается с небольшой примесью биуретового комплекса (методика 5.1 (б)) и продукт имеет голубой цвет с фиолетовым оттенком. Глицилглицинат меди (II) 5.1 (а) продукт ярко голубого цвета, хорошо растворяется в воде, разлагается при 196-198 °С. Продукты 5.1 (а, б) дают качественную реакцию на пептидную группу (фиолетовое окрашивание), с К4[Fe(CN)6] выпадает осадок краснобурого цвета Cu2[Fe(CN)6].

2+

В сильнощелочной среде (рН 10) глицилглицин с ионами Сu образует двойной комплекс одновременно по трем функциональным группам:  амино-, карбоксильной и пептидной, ди-(глицилглицинат)

дикупрат (6) (выход более 90%). В сильно щелочной среде пептидная группа из кетоформы превращается в иминольную (енольную) форму [7], в которой и взаимодействуют с ионами Cu (биуретовая реакция).

Схема реакции:

+ 2NaOH (pH 10)

NH CH C N CH COOH

II I

OH

NH CH C = N CH COONa

( ^_2H 2 O)            ^{2      2               2}

ОNa

1 стадия

2NH  CH C = N CH COONa ^{+2Cu2+(SO42-)}

^{2     2              2}              ( ^_Na₂SO₄)

ОNa

[NH CH C = N CH COO ] Cu

O _

2 стадия

Ди-(глицилглицинат) дикупрат (6) получается и при действии на хелатный комплекс (5) гидроксидом натрия и сульфатом меди (II) при рН реакции 10 с выходом более 90%.

Двойной комплекс – кристаллический продукт темно-фиолетового цвета, в воде растворяется с трудом, в спирте не растворяется. При температуре 205 ° С наблюдается начало разложения. В водном растворе с ионами Сu²⁺ K₄[Fe(CN)₆] образует осадок красно-бурого цвета Cu 2 [Fe(CN) 6 ].

Заключение. Изучена реакция комплексообразования глицилглицина с 3 d -биогенными металлами. Показано, что в слабокислой и слабощелочной средах комплексообразование глицилглицина с ионами марганца, железа, кобальта, меди, цинка идет по амино- и карбоксильной группам. В сильнощелочной среде комплексоообразование глицилглицина с ионами меди идет по трем функциональным группам, включая и пептидную группу. В оптимальных условиях синтезированы комплексонаты глицилглицина 3 d -биогенных металлов с высокими выходами, что позволяет исследовать их биологическую активность.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. т. 1 – М.: «Новая волна», 2000. с. 122-126; 2. Кабиров Г.Ф., Логинов Г.П., Хазипов Н.З. Хелатные формы биогенных металлов в животноводстве. – Казань: «ФГОУ ВПО КГВМ», 2004, 204 с.; 3. Гудашева Т.А. Стратегия создания дипептидных лекарств. // Инновация в современной фармакологии. Тез. докл. IV съезд фармакологов России. – Казань. 1821.09.2012; 4. Кадырова Р.Г., Кабиров Г.Ф., Муллахметов Р.Р. Разработка рационального способа получения комплексных солей марганца, железа с глицином и метионином. // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – Казань, 2013.– т. 216, с. 150-157; 5. Кадырова Р.Г., Кабиров Г.Ф., Муллахметов Р.Р. Синтез медных и цинковых солей метионина и глицина. // Ученые записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. – Казань, 2013.– т. 213, с. 109-115; 6. Дробилова О.М. Термодинамические характеристики координационных равновесий Р-аланина, L-серина, D, L-a-аланина, глицилглицина и глициласпарагина с ионами 3d-переходных металлов (II) в водном растворе: Автореф…диссерт…канд. хим. наук. – Иваново: ГХТУ, 2011.; 7. Грандберг И.И. Органическая химия. – М.: Дрофа, 2002. – 672 с.

ИЗУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСООБРАЗУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ГЛИЦИЛГЛИЦИНА С 3 d -БИОГЕННЫМИ МЕТАЛЛАМИ

Кадырова Р.Г., Кабиров Г.Ф., Муллахметов Р.Р. Резюме

В оптимальных условиях синтезированы комплексонаты глицилглицина 3 d -биогенных металлов с высокими выходами, что позволяет исследовать их биологическую активность.

GLYCYLGLYCINE COMPLEXABLE ABILITY STUDY WITH 3d-BIOGENIC METALS

Kadyrova R.G., Kabirov G.F., Mullakhmetov R.R. Summary

Under optimal conditions, glycylglycine complexonates of 3d- biogenic metals with high nutrient outputs were synthesized, what allows to explore their biological activity.