Изучение маркеров апоптоза, пролиферации и ангиогенеза у больных раком яичника, получивших сопроводительную иммунотерапию

Злокачественные опухоли яичника – одна из актуальных проблем в клинической онкологии. По данным Международного агентства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется более 192 тыс новых случаев рака яичника (РЯ) и более 114 тыс женщин умирают от злокачественных опухолей яичника [1, 2].

Химиотерапия наряду с хирургической операцией является одним из основных компонентов лечения РЯ. Однако различные побочные эффекты лечения, связанные с её токсическим воздействием на организм больной, заставляют исследователей искать пути их снижения, в том числе с помощью методов иммунотерапии [3].

Прогноз больных РЯ зависит от ряда клинических, морфологических, иммунологических и молекулярно-биологических факторов. Ведущими клиническими факторами являются стадия заболевания и стратегия лечения больных. Наряду с этим прогноз заболевания сопряжен с особенностями биологических свойств опухоли. Расширение знаний о молекулярных маркерах и изучение их экспрессии поможет прогнозировать течение заболевания. Большое внимание уделяется изучению степени амплификации генов и экспрессии соответствующих рецепторов и белков, характеризующих апоптоз, пролиферацию клетки и ангиогенез. Характеризуя биологические особенности каждой конкретной опухоли, молекулярные маркеры могут помочь в прогнозировании исхода заболевания и в индивидуализации лекарственного лечения [4, 5, 6].

За последние годы достигнуты успехи в исследовании иммунологии и иммунотерапии рака, в том числе злокачественных опухолей женской репродуктивной системы. Однако до сих пор не выработаны критерии выбора иммунологических методов, а также недостаточно изучена их эффективность у больных РЯ [7, 8].

Белок p53, являясь продуктом гена-супрессора опухоли TP53, экспрессируется во всех клетках организма. При отсутствии повреждений генетического аппарата белок р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК активируется. Результатом активации p53 является остановка клеточного цикла и репликации ДНК; при сильном стрессовом сигнале – запуск апоптоза.

Нарушения механизма развития апоптоза могут наступать тогда, когда ключевой ген этого процесса р53 теряет свою функцию. Это может наступить в результате мутации гена р53 с образованием мутантного онкопротеина – mut-р53, что наблюдается в условиях патологии или в результате блокады р53 другими протеинами, к которым, в первую очередь, относится Bcl-2. Увеличение экспрессии мутированного p53 в опухоли сопровождается его большей агрессивностью, поскольку уменьшается количество опухолевых клеток, подвергающихся апоптозу. При РЯ, по данным разных исследователей, мутантный р53 обнаруживается более чем у половины больных уже на ранних этапах заболевания [9].

Одним из наиболее изученных показателей агрессивности опухолевого роста является клеточная пролиферация, которая может быть оценена с помощью митотического индекса и индекса Ki-67. Антиген Ki-67 экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла, и в соответствии с этим отражает пролиферативный пул опухоли. Пролиферативный индекс Ki-67 рассматривается как независимый прогностический показатель возникновения рецидива, общей и безрецидивной выживаемости, предсказательный фактор для определения чувствительности к химиотерапии (ХТ) и лучевой терапии (ЛТ). Индекс Ki-67 позволяет оценить степень злокачественности опухоли и прогнозировать течение заболевания в совокупности с другими факторами. Показано, что высокий уровень индекса Ki-67 сопряжен с неблагоприятным прогнозом. В частности, при высоком уровне Ki-67 отмечается ухудшение показателей безрецидивной и общей выживаемости больных раком молочной железы, яичника, толстой кишки, мочевого пузыря, саркомах мягких тканей и др. При злокачественных опухолях яичника в большинстве случаев выявляется высокий уровень экспрессии Ki-67 [3]. В некоторых работах, посвященных РЯ, показано, что амплификация HER-2/neu, встречающаяся в 10–50%, указывает на неблагоприятный прогноз течения заболевания [10]. Однако существуют и противоположные данные, поэтому практическая значимость HER-2/neu-тестирования остается на сегодня дискутабельной [11, 12]. В последнее время выяснилось, что некоторые муцинозные карциномы яичника имеют амплификацию гена HER2/neu и гиперэкспрессию его белка [13, 14]. В недавно опубликованных результатах геномного анализа 50 образцов светлоклеточного рака яичника показано наличие амплификации HER2/neu в 14% случаев [15]. Получается, что при редкой частоте гиперэкспрессии HER2/neu и амплификации его гена в общей группе карцином яичника в подгруппе муцинозных и светлоклеточных карцином этот рецептор встречается значительно чаще.

Рецептор эпидермального фактора роста EGFR является трансмембранным гликопротеином, локализующимся на хромосоме 7р12. EGFR функционирует через димеризацию, активируя тирозинкиназу, участвуя в регуляции нормальной и неопластической клеточной пролиферации. Семейство рецепторов EGFR состоит из 4 членов: EGFR/ ErB1/HER1, ErbB2/Neu/HER2, ErB3/HER3 и ErB4/HER4. В нормальных физиологических условиях активация HER-рецепторов контролируется временной невысокой экспрессией их лигандов. При трансформации клеток наблюдается гиперэкспрессия этих белков и увеличение количества рецепторов на поверхности клеток. EGFR присутствует во многих нормальных тканях и выраженная экспрессия наблюдается в солидных опухолях. Согласно данным литературы, экспрессия EGFR наблюдается примерно в 40% злокачественных опухолей ЖКТ, легкого, яичников, матки [16, 17, 18].

Основным активатором ангиогенеза считают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), ответственный за пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, а также имеющий непосредственное отношение к инвазии и метастазированию опухоли. Накоплены данные, подтверждающие участие VEGF и эпидермального фактора роста (EGF) в построении сосудистого русла, росте и прогрессии злокачественных новообразований. Причем взаимодействие этих лигандов с трансмембранными тирозинкиназными рецепторами рассматривают как важнейший аутокринный путь промоции опухоли. При РЯ различные исследователи отмечают высокую экспрессию VEGF [19, 20].

Таким образом, определение индивидуального профиля онкомаркеров у больных РЯ может способствовать более точному представлению о развитии заболевания и прогнозу об эффективности проводимого лечения, а также необходимости проведения сопроводительной иммунотерапии.

ЦЕЛЬ

Целью работы явиляется изучение ряда молекулярно-биологических маркеров опухоли в качестве критериев выбора методов сопроводительной иммунотерапии у больных РЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили 30 больных РЯ с II– III клиническими стадиями заболевания, проходивших лечение в онкогинекологическом отделении РОНЦ МЗ РУз с 2009 по 2011 гг. и получивших стандартное комбинированное лечение.

Всем больным РЯ выполнялась комбинированная терапия в неоадъювантном режиме, включающая ПХТ по схеме

Таблица 1. Группы больных раком яичника, n=30 Методы иммунотерапии Абс. % 1. Контрольная (без иммунотерапии) 11 36,7 2. ЭИФТ 10 33,3 3. ЭИФТ + плазмаферез 9 30,0 цисплатин 75 мг/м2 + циклофосфан 1000 мг/м2 в течение 4 дней по 2–4 курсов 1 раз в 3 недели и хирургическое лечение в объеме радикальной или циторедуктивной операции. В последующем проводили 6 курсов адъювантной ПХТ 6 курсов 1 раз в 3 недели.

В 1-й (контрольной) группе больных иммунотерапию не проводили (табл. 1).

Во 2-й группе больным РЯ проводили ЭИФТ путем эксфузии 200–250 мл аутокрови в стерильные контейнеры «Ге-макон» или «Терумо», инкубацией с иммуномодулятором тималином в суммарной дозе 30 мг (за 3 процедуры) при 37 ° С в течение 60-100 мин с последующей реинфузией полученного конъюгата.

В 3-й группе пациенток применяли метод ЭИФТ, который являлся расширением возможностей плазмафереза. Осуществляли эксфузию 500–1000 мл аутокрови в стерильные контейнеры «Гемакон» или «Терумо», затем проводили ее центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 мин. Удаляли 50–80 мл надосадочного слоя плазмы крови, содержащего антитела, циркулирующие иммунные комплексы, цитокины, продукты клеточного метаболизма. Затем полученную лейкотромбомассу и эритроцитарную массу инкубировали с тималином в суммарной дозе 30 мг (за 3 процедуры) при 37 ° С в течение 60-100 мин, с последующим возвращением конъюгата в кровеносную систему больных.

Возраст обследованных больных РЯ составил от 27 до 72 лет, средний возраст – 41,7±7,5 лет.

Стадирование заболевания проводилось согласно Международной клинической классификации TNM (7-е издание, 2006 г.).

Изучение данных анамнеза показало, что у большей части (у 43,8%) пациенток анамнез заболевания составил от 1 до 3 месяцев.

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала первичной опухоли больных РЯ, полученные до начала исследования. Образцы опухолевой ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин. Гистологиче- ские препараты окрашивали обычными способами и проводили иммуногистохимические исследования.

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратиро-вали по стандартной методике. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB+ систему [DakoCytomation, Дания]. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа «Leica» (Германия) под увеличением х10; х20; х40. Для маркера оценивали локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма, мембрана). Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В иммуногистохимической оценке экспрессии p53 использовали моноклональные мышиные антитела к р53 (клон DO-7), VEGF (клон VG1), Ki-67 (клон M1B-1), EGFR (клон E30) и кроличьи антитела к c-erbB-2 (клон pAb) (DakoCytomation, Дания).

В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:

• 1.    Опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток.

• 2.    Опухоль считали отрицательной по VEGF, EGFR и HER-2/ neu, если в ткани опухоли отсутствовала цитоплазматическая реактивность с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25%; и положительной, если было окрашено более 25% опухолевых клеток.

• 3.    Для оценки пролиферативной активности (ПА) опухоли подсчитывали количество Ki-67-положительных опухолевых клеток, приходящихся на 200–300 опухолевых клеток. Индекс Ki-67 определяли по формуле: ПА = число Ki-67-положительных клеток х 100/общее количество клеток. При этом пролиферативная активность опухоли оценивалась как процент Ki-67 положительных клеток от общего количества опухолевых клеток. Высокая пролиферативная активность соответствовала индексу Ki-67>40%, низкая пролиферативная активность опухоли соответствовала индексу Ki-67 <40%.

При статистической обработке результатов исследования рассчитывали значения средних величин с показателями их ошибок. Для сравнения достоверности различий между средними величинами использовали критерий Стьюдента. Данные считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При назначении методов экстракорпоральной иммунотерапии больным мы старались учитывать в наибольшем объеме результаты клинико-диагностических исследований.

86,7

83,3      ₈₀

16,6             20703013,3         20

p53

Her-2neu

EGFR

VEGF

Ki-67

Отрицательный уровень Положительный уровень

Рис.

1. Количество больных раком яичника с отрицательным

и положительным уровнями изучаемых онкомаркеров

p53(-)     p53(+) Her-2neu(-) Her-2neu(+) EGFR(-) EGFR(+)

1 группа без иммунотерапии 2 группа ЭИФТ без ПФ 3 группа ЭИФТ с ПФ

Рис. 2. 5-летняя выживаемость больных раком яичника в зависимости от вида иммунотерапии и экспрессии молекулярно-биологических маркеров опухоли р53, Her-2/neu, EGFR

VEGF(-) VEGF(+) Ki-67(-)    Ki-67() ПА низкая ПА высокая

1 группа без иммунотерапии 3 группа ЭИФТ без ПФ 3 группа ЭИФТ с ПФ

Рис. 3. 5-летняя выживаемость больных раком яичника в зависимости от вида иммунотерапии и экспрессии молекулярно-биологических маркеров VEGF, Ki-67, а также пролиферативной активности (ПА) опухоли

Наилучшие результаты после проведения иммунотерапевтических методов наблюдались в 3-й группе больных, что выражалось в улучшении общего анализа крови, умень-

шении лейкопении и лимфопении, а также нормализации показателей В-лимфоцитов, CD4+, CD8+ и NK. Менее выраженные результаты наблюдались во 2-й группе больных. Степень токсичности химиотерапии у больных РЯ устанавливали по шкале CTC-NCIC. В контрольной группе больных РЯ наиболее часто наблюдалась картина нейтропении и нейропатии на фоне угнетения миелопоэза. Выраженность таких побочных проявлений химиотерапии, как анемия, лейкопения, ухудшение аппетита, тошнота и аллопеция, у части больных составляла третью степень токсичности. Под влиянием ЭИФТ наблюдалось заметное уменьшение токсических эффектов химиотерапии.

Отрицательный уровень р53 был отмечен у 5 (16,6%) пациенток, положительный – у 25 (83,3%) (Рис. 1). Соответствующие показатели при изучении HER-2/neu обнаруживались у 24 (80,0%) и 6 (20,0%) пациенток, при изучении EGFR – у 21 (70,0%) и 9 (30,0%), VEGF – у 4 (13,3%) и 26 (86,7%) и при изучении Ki-67 – у 6 (20,0%) и 24 (80,0%) пациенток.

Таким образом, у большей части больных РШМ уровень изучаемых онкомаркеров был положительным, за исключением HER-2/neu и EGFR, которые были отрицательными у 80,0 и 70,0% пациенток соответственно.

Наиболее высокие показатели 5-летней выживаемости отмечались в группе больных, которым проводилась ЭИФТ с плазмаферезом. Так, в контрольной группе больных выживаемость с отрицательным уровнем р53 составила 62,6±6,8%, тогда как в группах с ЭИФТ и ЭИФТ+ПФ эти показатели составили 74,1±6,7 (р>0,05) и 78,1±7,7% (р>0,05) соответственно (Рис. 2). При положительном значении данного онкомаркера 5-летняя выживаемость составила 43,8±5,8% для контрольной группы без иммунотерапии и 58,6±6,7 (р<0,05) и 60,4±6,3% (р>0,05) для групп с применением методов иммунотерапии соответственно.

Показатели 5-летней выживаемости в контрольной группе больных при рассмотрении маркера HER-2/neu составили 62,7±4,6% при отрицательном его уровне и 55,2±6,4% – при его положительном значении (Рис. 2). Соответственно, в группах с иммунотерапией данный показатель составил 68,2±7,2 (р<0,05) и 74,3±6,7% (р<0,05) при отрицательном уровне и 69,8±6,5 (р>0,05) и 77,1±6,7% (р>0,05) – при его положительном значении.

При рассмотрении маркера EGFR было показано, что при его отрицательном значении в группе без иммунотерапии 5-летняя выживаемость составила 64,4±5,8%, а при положительном – 57,2±6,0% (Рис. 2). В группе с ЭИФТ соответствующие показатели составили 72,4±6,9 (р>0,05) и 65,7±5,6% (р>0,05), а в группе с ЭИФТ+ПФ – 74,8±7,4 (р<0,05) и 68,0±6,8% (р>0,05).

При отрицательном значении уровня VEGF в контрольной группе 5-летняя выживаемость пациенток составила 69,4±5,8 и при положительном – 54,0±6,0% (Рис. 3).

В группах больных, в которых применялась сопроводительная иммунотерапия, соответствующие значения при отрицательном значении VEGF составили 78,5±6,8 (р>0,05) и 76,3±7,2% (р>0,05), при положительном уровне данного онкомаркера – 61,0±6,7 (р<0,05) и 68,3±7,3% (р<0,05).

Онкомаркер Ki-67 не обнаруживался в опухолях 6 больных, у которых в контрольной группе 5-летняя выживаемость составила 68,4±6,9% (Рис. 3). При его положительном уровне в группе без иммунотерапии данный показатель составил 41,8±3,8%. В группах с проведением ЭИФИ и ЭИФТ+ПФ при отрицательном Ki-67 показатели выживаемости составили 78,1±6,5 (р>0,05) и 76,8±7,9% (р>0,05) соответственно, а при положительном – 58,6±6,3 (р<0,05) и 60,4±6,5% (р<0,05).

При низком уровне индекса ПА, который высчитывали по Ki-67, 5-летняя выживаемость в группе без иммунотерапии составила 68,3±7,7, при высоком его уровне – 49,4±5,4% (Рис.3). В группах с применением имммунотерапевтиче-ских методов 5-летняя выживаемость при низком индексе ПА составила 76,1±7,8 (р>0,05) и 79,2±8,0% (р>0,05), при высоком индексе – 64,2±6,8 (р<0,05) и 69,8±6,7% (р>0,05).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые исследования позволили установить, что у большей части больных РЯ (у 83,3, 86,7 и 80,0% соответственно) присутствовали молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67. В то же время, маркеры HER-2/neu и EGFR обнаруживались у 20,0 и 30,0% пациенток соответственно. При этом положительный уровень маркеров p53, VEGF и Ki-67 оказывал заметное негативное влияние на показатели 5-летней выживаемости больных РЯ, в случае же HER-2/neu и EGFR такое влияние было не столь выраженным, что указывает на их меньшую прогностическую значимость при данном заболевании.

При этом наибольший эффект в увеличении 5-летней выживаемости больных РЯ оказывала схема сопроводительной иммунотерапии, включающая ЭИФТ с плазмаферезом: такое влияние данного метода проявлялось как при положительных, так и при отрицательных уровнях рассмотренных онкомаркеров.

Таким образом, положительный уровень окомаркеров p53, VEGF и Ki-67 у больных РЯ наряду с высокой ПА опухоли, может служить основанием для проведения данной категории пациенток сопроводительной иммунотерапии с ЭИФТ. В случае положительных значений всех рассмотренных молекулярно-биологических факторов мы рекомендуем проведение сопроводительной ЭИФТ с плазмаферезом, что может существенно увеличить эффективность стандартных схем противоопухолевого лечения.

ВЫВОДЫ

• 1.    У большей части больных раком яичника (у 83,3, 86,7 и 80,0% соответственно) присутствовали молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67. В то же время, маркеры HER-2/neu и EGFR обнаруживались у 20,0 и 30,0% пациенток соответственно.

• 2.    Наибольшей прогностической значимостью в отношении эффективности лечения больных раком яичника обладают молекулярно-биологические маркеры p53, VEGF и Ki-67, а также уровень пролиферативной активности (ПА) опухоли.

• 3.    При положительном уровне маркеров p53, VEGF, Ki-67, а также при высокой ПА опухоли, 5-летняя выживаемость больных в группе без сопроводительной иммунотерапии составила 43,8±5,8, 54,0±6,0, 41,8±3,8 и 49,4±5,4% соответственно, тогда как при отрицательном значении данных маркеров и низком уровне ПА, показатели выживаемости составили 62,6±6,8, 69,4±5,8, 68,4±6,9 и 68,3±7,7% соответственно.

• 4.    Использование в схемах лечения рака яичника сопроводительной иммунотерапии с ЭИФТ позволяет увеличить 5-летнюю выживаемость от 6,1 до 18,8%, в зависимости от схемы иммунотерапии и уровня рассмотренных онкомаркеров.

• 5.    Наибольшей эффективностью в увеличении 5-летней выживаемости больных раком яичника обладает схема сопроводительной иммунотерапии, включающая ЭИФТ с плазмаферезом: такое влияние данного метода проявлялось как при положительных, так и при отрицательных уровнях всех рассмотренных онкомаркеров.