Изучение механизмов противомикробного действия соединения (+)-erogorgiane

Туберкулез, вызываемый Mycobacterium tuberculosis, уже в течение многих десятилетий остается одной из главных проблем здравоохранения, являясь причиной более чем миллиона смертей ежегодно [WHO Global Tuberculosis Report, 2015]. Наиболее существенной проблемой, препятствующей эффективному лечению туберкулеза, является быстрое появление ангибиотикорезистснгных форм возбудителя.

Особую тревогу' вызывает распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, которое делает существующие методы лечения неэффективными [Migliori, Sotgiu. Gandhi et al, 2013J. Лечение лекарственно устойчивых форм туберкулеза ? как правило, является дорогостоящим и предусматривает использование высокотоксичных препаратов с многочисленными побочными эффектами. В связи с Этим актуальным является поиск новых эффективных противотутберкулезных средств.

В последние годы внимание исследователей привлекли морские кораллы Pseudopterogorgia elisabethae, обитающие в Карибском море и продуцирующие необычные соединения, обладающие

(С Нестерова Л. Ю., Ткаченко А. Г., Писцова О. Н , 2016

фармакологической активностью. Ранее было обнаружено. что соединение дитерпеновой природы (+)-erogorgiane, выделенное из этих организмов,, обладает противотуберкулезной активностью [Do Souza. 2006], однако, изучение сто биологических свойств не проводилось в связи с трудностями его выделения из морских кораллов. Следует отметить что данное соединение по своей структуре значительно отличается от используемых в клинической практике антибиотиков различных классов. Исходя из этого, можно предполагать. что (+)-erogorgiane имеет принципиально иной способ воздействия на бактерии.

Поскольку’ для оценки возможности дальнейшего использования данного вещества в качестве лекарственного средства необходимо понимание механизмов действия антибиотика, целью данной работы является изучение антибактериальной активности и возможных механизмов противомикробного действия искусственно синтезирова иного соединения (+)-erogorgiane, которое является аналогом природного вещества, выделенного из морских кораллов.

Для изучения биологической активности и механизмов антибактериального действия (+)-erogorgiane в качестве объекта исследования выбран микроорганизм Mycobacterium smegmatis. близкий к М. tuberculosis^ в то же время нспато-генный и быстрорастущий и потому широко используемый в качестве модельного объекта при исследованиях физиологии возбудителя туберкулёзной инфекции.

Материалы и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали штамм Mycobacterium smegmatis me'155. который сохраняли на чашке Петри с LB агаром (Sigma), культивировали на среде Middlebrook 7Н9 (Difco) с добавлением 0.005% Tween 80 при 37°С, 200 об/мин и штамм Escherichia coli GC 4468, который сохраняли на скошенном LB агаре и культивировали на глюкозо-минеральной среде М9 в термостатируемом шейкере GFL 1092 (Германия) 37°С 100 об/мин.

Для определения антибиотикочувствительности полученный инокулят разводили свежей средой до оптической плотности (ОП) 0.1 (□=600нм), доращивали в указанных условиях до нужной стадии роста и помещали 180 МКЛ культуры в лунки полистиролового 96-лу ночного планшета, куда добавляли 20 мкл раствора антибиотика нужной концентрации и тщательно перемешивали. Культивировали без перемешивания (время культивирования указано на графиках). По окончании культивирования количество живых клеток определяли с помощью подсчета колониеобразутощих единиц (КОЕ) после высева проб на чашки Петри с LB агаром.

Для определения влияния антибиотика на био- пленкообразование М. smegmatis выращенную в течение 24 ч. культуру откручивали на центрифуге, удаляли надосадочную жидкость и ресуспендиро-вали в свежей среде Middlebrook 7Н9 (Difco) без добавления Tween 80, доводя до ОП 0.L затем разводили ещё в 10 раз и помещали в лунки планшета. Культивировали в термостате при 37°С без встряхивания. Через 48 ч. из лунок осторожно удаляли планктонную культуру поверхностную пленку' высушивали и фотографировали. Для определения количества КОЕ в соответствующих пробах производили аналогичный посев на среду, содержащую 0.005% Tween 80. затем готовили десятикратные разведения и делали высевы на LB агар.

Профили поверхности клеток изучали с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) с использованием совмещенной системы сканирования, состоящей из атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D-BIO (Asylum Research. США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FV1000. (Olympus Corporation, Япония). Сканирование осуществляли в полукон-тактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50-90 кГц и константой жесткости 0.5-4.4 Н/м. Для характеристики структуры поверхности клеток (шероховатость Sq, индекс I) получали двух- и трехмерные топографические изображения бактерий. Обработку' микрофотографий проводили с помощью программы Igor Pro 6.22 А (WaveMetrics. США).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета стандартных программ Statistica 6.0 (“StatSoft ТпсД 2001). Различия считали значимыми при р<0.05.

Результаты и их обсуждение

На первом этапе исследования была проведена оценка характера и интенсивности антибактериального действия исследуемого вещества. Показано, что (+)-erogorgiane обладает бактерицидным действием по отношению к М. smegmatis. При этом с увеличением времени воздействия снижается концентрация, которая вызывает полную гибель клеток в культуре (рис. 1А). При более подробной расгитровкс исследуемого препарата удалось установить концентрации, которые оказывают сублс-тальное действие, те. снижают количество клеток, не вызывая полной гибели культуры (рис. 1В). Однако разница между’ суббактериостатическими концентрациями, которые не оказывают влияния на количество клеток, и бактерицидными концентрациями была невелика. Данные концентрации отличались менее чем в 2 раза (рис. 1В). Следует отметить, что бактерицидный эффект исследуемого препарата проявлялся как по отношению к культуре, находящейся в логарифмической фазе роста, так в стационарной (рис. 1С), которая в большинстве случаев является более резистентной к действию различных неблагоприятных факторов, в том числе антибактериальных препаратов [Leisner, Jorgensen, Middelboe. 2016].

концентрация мг/мл

концентрация мг'мл

Рис. L Бактерицидное действие антибиотика на культуру Mycobacterium smegma tis.

Ашибиотк добавляли в культуру в ло^рифмической (А, В, С) и стационарной (С) фазе роста. Экспозиция с антибиотиком 1 - 5 ч ; 2, С - 24 ч.; 3 - 48 ч.

Эффект антибиотика проявлялся также по отношению к нерастущим клеткам, которые были помещены в буфер и после этого подвергнуты действию антибиотика. Такие клетки являются более устойчивыми к действию антибиотиков. Традиционные антибиотики, применяемые для лечения туберкулеза. такие как изониазид, рифампицин и ле-вофлоксацин, в аналогичных условиях нс приводили к полной гибели культуры. Более того, в культуре, взятой в стационарной фазе роста, изониазид практически не имел эффекта на количество клеток, а рифампицин снижал число клеток на 2 порядка (рис. 2). В этом эксперименте мы использовали концентрации антибиотиков, которые намного превышают терапевтические и в 100 раз превышают концентрации, которые препятствуют росту культуры (МПК). Таким образом, (+)-erogorgianc, в отличие от традиционных антибиотиков, способен нс только препятствовать размножению микобактерий, но и полностью убивать клетки вне зависимости от стадии роста культуры, препятствуя образованию персисторных форм ми-

Рис. 2, Действие антибиотиков на нерастущую культуру М. smegmatis.

Антибиотики добавляли в культуру М. smegmatis^ взятую из логарифмической (светлые столбцы) и стационарной (черные столбцы) фазы роста, отмытую от питательной среды и ресуспецдированную в PBS , буфере. Экспозиция 24 ч.

К - контроль без добавки антибиотика; RIF - рифампицин (488 мкг/мл); IS - изониазид (488 мкг/мл); LF -левофлоксацин (63 мкг/мч); ER - (+)-erogorgiane (399 мкг/мч)

Грамотрицательный микроорганизм Esch eri -chia coU. в свою очередь, оказался совершенно нечувствительным к исследуемому антибиотику⁷. Нам не удалось обнаружить не только бактерицидного, но также и бактериостатического эффекта ни в одной из исследованных концентраций препарата. Исходя из этого, можно предположить, что мишень для действия (+)-erogorgiane специфична для грамположительных микроорганизмов, а возможно, для микобактерий. Несмотря на то, что действие исследуемого соединения на культуру Е. сой не сопровождается гибелью клеток, нами был обнаружен отклик некоторых генов, ответственных за адаптацию этого микроорганизма к стрессовым условиям на его действие (данные не показаны). Данный подход будет использован для дальнейшей работы по расшифровке механизма действия антибиотика.

Следующий этап исследований был посвящен оценке влияния (+)-erogorgianc на способность М. smegmatis к биопленкообразованию. Известно, что микроорганизмы в составе биопленок значительно более устойчивы к действию антибиотиков и иммунной системы хозяина [Syal, Maiti, Naresh et al., 2016]. Хотя роль биопленкообразования в патогенезе микобактерий остается неясной, многие их виды способны формировать биопленки [Arai, Niikawa, Kobayashi, 2013].

Установлено, что присутствие (+)-erogorgiane подавляет биопленкообразование М, smegmatis (рис. 3). Ингибирующее действие оказывали как суб л стальные, так и субингибиторные концентрации препарата, которые не имели эффекта на рост культуры и не вызывали гибели клеток (рис. 3). Влияние исследуемого препарата на биопленкообразование может осуществляться посредством различных механизмов, поскольку7 процесс формиро- вания биопленок у микобактерий регулируется множеством факторов [Sharma, Petchiappan, Chatter] L 2014]. Одним из возможных механизмов является изменение поверхностных структур клетки, которое, в свою очередь, влияет на способность бактерий формировать биопленки [Aguayo, Bozec,

1      2      3     4     5     6     7 В

Рис. 3* Влияние (±)-erogorgiane на биопленко-об ра зовам ие A A smegmatis.

На фото поверхностная биопленка после высушивания. Столбики диаграммы отображают количество КОЕ в лунках. соответствующих лункам на фото, с добавлением Tween 80.

Концентрация антибиотика: 1:2 - контроль без антибиотика. 3 - 0.594 мг/мл: 4 - 0.297: 5 - 0.148 мг/мл: 6 -0,074 мг/мл; 7 - 0.037 мг/мл; 8 - 0.019 мг/мл

Отсутствие действия препарата на клетки гра-мотрицательных Е. с oh свидетельствует о том, что возможной мишенью для действия антибиотика является клеточная стенка грамположительных бактерий. В пользу этого предположения также свидетельствуют и данные, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии. Установлено, что под действием сублетальных концентраций (±)-erogorgiane происходит статистически достоверное возрастание шероховатости поверхности клеток А/. smegmatis по отношению к контролю (таблица).

Изменение шероховатости клеточной поверхности под действием антибиотика

Вариант опыта	Шероховатость Sq, нм
Контроль	153.8 (±7,5)
Сублетальная концентрация (+)-erogorgiane (0,297 мг/мл)	217.0 (±21.6) *

Приведены средние значения шероховатости ± с.

*- статистически значимое отличие от контроля без добавки антибиотика. Достоверность различий определяли с помощью критерия Ньюмена—Кейлса.

Предполагалось, что следующим этапом работы должен стать анализ мутантов, устойчивых к действию (+)-erogorgiane. Однако наши попытки получить устойчивые клоны высевом большого количества клеток на твердую среду, содержащую высокие концентрации препарата [Kern, Oethinger, Jellen-Ritter, et al. 2000], не дали результатов. Возможно, это связано с особенностями действия данного антибиотика. Можно предположить, что мутаций в одном или двух генах недостаточно, чтобы микроорганизм стал нечувствителен к данному соединению, как это имеет место в отношении других антибиотиков [McMurry, McDermott, Lexy, 1999; Telenti. Honore, Bernasconi etal., 1997].

Заключение

Таким образом, искусственно синтезированный аналог природного антибиотика (+)-erogorgiane оказывает бактерицидное действие на клетки М smegmatis независимо от стадии роста культуры, а также на нерастущие клетки. Данное вещество в сублетальных концентрациях препятствует образованию биопленок микобактериями.

Несмотря на то, что на данном этапе исследований нельзя точно указать конкретный механизм действия (±)-erogorgiane на клетки микобактерий, нами установлено, что его действие приводит к изменению поверхностных структур клетки.

Работа выполнена при поддержке РНФ (проект 15-13-00092).