Изучение микроорганизмов, участвующих в процессе вермикомпостирования

В XX в. земледелие достигло значительных успехов благодаря выведению высокопродуктивных сортов и гибридов, широкомасштабному применению пестицидов и высоких доз удобрений, что оказало положительное влияние на решение продовольственной проблемы. Но в то же время такая техногенная интенсификация вызвала целый ряд экологических проблем, связанных с загрязнением почв, водоемов и грунтовых вод, а также сельскохозяйственной продукции. Исходя из этого, остаются актуальными поиск и разработка мер по улучшению качества сельскохозяйственной продукции и повышению урожайности культурных растений без химической нагрузки почв.

В последнее время во многих странах мира получило распространение вермикомпостирование, которое заключается в промышленном разведении и использовании дождевых червей. Формирование и развитие одного из новых направлений биотехнологии обусловлено возможностью решения на биологической основе ряда актуальных экологических задач, таких как утилизация органических отходов; получение высококачественного, экологически чистого органического удобрения и безопасной сельскохозяйственной продукции; повышение плодородия почв. Дождевые черви поглощают и переваривают органические вещества, обогащают почву копролитами, ферментами, витаминами, большим количеством собственной кишечной микрофлоры и биологически активными веществами, которые обладают антибиотическими свойствами, а также препятствуют развитию патогенной микрофлоры. В кишечнике дождевых червей происходят биохимические изменения органических отходов путем образования гумусовых веществ, отличных по химическому составу от гумуса почв [1].

В связи с этим научно обоснованное применение технологии вермикомпостирования в сельском хозяйстве экологически безопасно и экономически эффективно. Качество биогумуса зависит от вида дождевых червей, условий их выращивания и свойств используемого компоста. Для получения биогумуса применяются красные калифорнийские черви Eisenia foetida andrei [11].

Одним из субстратов для вермикомпостирования является птичий помет. В зависимости от условий хранения в 1 г пометной массы находится до миллиарда микробных клеток разнообразных групп микроорганизмов (грибы, актиномицеты, дрожжи, бактерии и др.), присутствуют бактериофаги, личинки гельминтов и насекомых [9]. В птичьем помете содержатся мочевая кислота, мочевина, аммиак, креатин, орнитуровая кислота, а также гуанин, который является предшественником гуанинсодержащих нуклеиновых производных [8].

Образование гуанозинмонофосфата (ГМФ) из гуанина с помощью B. ammoniagenes АТСС 6872 доказано трансформацией нуклеиновых оснований, или «сэлвидж-синтезом» [10].

Биотрансформация низкомолекулярных нуклеиновых производных при вермикомпостирова-нии, а также роль микроорганизмов, принимающих участие в этом процессе, являются малоизученной областью биотехнологического процесса.

Цель работы – выделение и исследование микроорганизмов, участвующих в вермикомпостиро-вании, изучение их способности к биотрансформации гуанина птичьего помета.

Материалы и методы

Объектами исследований являлись биогумус, копролиты и кишечник калифорнийского червя Ei-senia foetida andrei семейства Lumbricidae, которые используются в процессе вермикомпостирования органических отходов в научно-производственном цехе птицефабрики СХАО «Белореченское» Усольского района Иркутской области. Пробы отбирались в соответствии с требованиями ГОСТ 17.4.4.02-84 Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа [3]. Выделение бревибактерий из кишечника калифорнийского червя проводили бактериологическим методом из опада, подстилки, почвы, компостов и низших организмов почвы [5].

Силикатные бактерии B. mucilaginosus выделяли из почвенной вытяжки биогумуса на селективной среде Зака. Для экстракции микроорганизмов и удаления взвешенных частиц почвенную взвесь взбалтывали и фильтровали. Сопутствующая вегетативная микрофлора в фильтрате инактивировалась прогреванием в течение 20 мин на водяной бане (80 °С). Спорообразование происходило при температуре 37 °С в течение первых трех суток и затем при температуре 4 °С на 4-5-е сутки [2].

Выделенные культуры идентифицировали классическим бактериологическим и приборным методами. Бактериологический анализатор Vitek-2 Compact (bioMerieux CA , Франция) позволяет исследовать одновременно до 30 проб по 46 дифференциальным тестам на одноразовых картах для идентификации BCL (Bacillus identification card). Дифференциация бацилл на карте BCL основана на стандартных биохимических методах с использованием субстратов, позволяющих оценивать утилизацию углеводов, ферментативную активность, ингибирование роста и устойчивость к антибиотикам (канамицин, олеандомицин, полимиксин). Для исследования биохимической активности классическим бактериологическим методом использовали 20 тестов [5].

В качестве контроля выбран хранившийся в лиофилизированном состоянии штамм B. subtilis 723 из музея живых культур ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора.

Для отбора микроорганизмов, продуцирующих гуаниновые нуклеотиды, использовали среду Misawa. Способность выделенных микроорганизмов синтезировать гуаниновые нуклеотиды проверяли методом ферментации [4].

Качественное определение гуанина проводили с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол UV–254» в системе растворителей пропанол-1 – аммиак – вода (20:12:3). Количественное содержание гуанина определяли методом бумажной хроматографии. В качестве стандартных растворов использовали гуанин и гуанозинмонофосфат (ГМФ) (Sigma). Вырезанные участки хроматограммы, поглощающие ультрафиолетовую область спектра, измельчали и элюировали 0,01 N раствором соляной кислоты в течение 4 ч. В элюате определяли оптическую плотность (диапазон 220–290 нм) с помощью спектрофотометра Bio-Tek Instruments [7].

Качественное определение гуаниновых нуклеотидов в птичьем помете и биогумусе проводили экстракцией 4%-ной хлорной кислотой с последующим центрифугированием, надосадочную жидкость исследовали хроматографическими методами [7].

Результаты исследований

Из биогумуса, копролитов и кишечника калифорнийских червей выделили три штамма микроорганизмов, которые были идентифицированы бактериологическим методом как силикатные бактерии Вacillus mucilaginosus (два штамма – № 1 и 2) и бревибактерия Brevibacterium brevis (№ 3).

По культуральным и морфологическим свойствам выделенные штаммы не имели существенных отличий от контрольного штамма B. subtilis 723 . На мясо-пептонном агаре (рН 7,2) при температуре 37 °С в течение 24 ч выросли колонии до 2-3 мм в диаметре, светло-белые, выпуклые, с гладкой поверхностью и вязкой однородной консистенцией. На 1-е сутки пигментация отсутствовала, но с увеличением срока инкубации колонии меняли свою окраску от светло-кремового до коричневого оттенков. В бульоне Хоттингера и мясо-пептонном бульоне (рН 7,2) наблюдали легкую опалесценцию, рост на дне пробирки в виде хлопьев или нитей. При микроскопии мазков – крупные грамполо-жительные палочки.

У выделенных штаммов № 1, 2 и 3 в конце первых суток инкубации на 5%-ном кровяном агаре гемолитическая активность отсутствовала. На 2-е сутки в результате полного лизиса эритроцитов вокруг колоний образовалась прозрачная зона β-гемолиза. Гемолитическая активность контрольного штамма B. subtilis 723 также проявилась на 2-е сутки.

Для определения оптимальных значений температуры и кислотности (рН) штаммов В. mucilaginosus и Br. brevis в мясо-пептонном бульоне были апробированы несколько температурных режимов инкубации (16, 22, 28, 37, 45 °С) и различных показателей рН (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5). Установлено, что оптимальными условиями роста изучаемых штаммов являлись температура 28±1 °С и рН 6,5-7,0, при этом критерием служило увеличение биомассы исследованных культур.

Штаммы № 1 и 2 ( B. mucilaginosus ) на средах Гисса сбраживали 7 сахаров (глюкоза, арабиноза, сахароза, лактоза, манноза, галактоза, маннит) и не разлагали арабинозу, инозит и крахмал. У штамма № 1 биохимическая активность по отношению к лизину, орнитину, аргинину на средах Биргер-Крушинской отсутствовала, в отличие от штамма № 2. Результаты исследования на баканализаторе совпадали с данными классического бактериологического метода по 9 сахарам и 3 аминокислотам.

Штамм № 3 ( Br. brevis ) в отличие от двух других на средах Гисса гидролизовал только галактозу и маннит, был неактивен в отношении 6 сахаров (глюкоза, арабиноза, сахароза, лактоза, крахмал, манноза). Штамм не разлагал лизин и орнитин, но был активен по отношению к аргинину. Результаты исследований баканализатора Vitek-2 Compact совпадают с данными классического бактериологического метода по утилизации 7 углеводов и декарбоксилированию 3 аминокислот.

Контрольный штамм B. subtilis 723 гидролизовал 5 сахаров (глюкоза, сахароза, манноза, галактоза, маннит) до кислоты без образования газа и в отличие от культуры № 3, расщеплял аргинин и орнитин, но не разлагал лизин.

Все исследуемые и контрольный штаммы подвижны в 0,3%-ном полужидком агаре; не разрушали мочевину; обладали такими ферментами, как лейцинариламидаза, фенил аланинариламидаза, тирозинариламидаза, глицинариламидаза и отсутствием бета-маннозидазы; не гидролизовали углеводы циклодекстрин, гликоген, D-мелецитоза, метил-р-ксилоза.

По результатам бактериологических исследований классическим методом выделенные штаммы отнесены к родам Bacillus и Brevibacterium , видовая принадлежность подтверждена их идентификацией на бактериологическом анализаторе Vitek-2 Compact (табл.). Из 46 тестов карты BCL баканали-затора у B. mucilaginosus № 1 положительно реагировали 29 тестов (63,0 %), у B. mucilaginosus № 2 – 28 (60,8 %). Биохимическая активность штаммов № 1 и 2 была идентична по 28 показателям. Штамм № 3 показал положительные результаты в 16 тестах (34,8 %), контрольный штамм – 14 (30,4 %).

При оценке способности исследуемых микроорганизмов синтезировать ГМФ из гуанина была отобрана культура Br. brevis . Результаты исследования показали, что содержание гуанина в процессе ферментации по методу Misawa снизилось в 3,9 раза (с 3,1 до 0,8 мг/г). Изменение содержания гуанина и образование ГМФ в процессе вермикомпостирования могут свидетельствовать об участии штамма Br. brevis в биотрансформации.

Таблица

Изучение культурально-биохимических свойств выделенных штаммов

• В.    mucilaginosus и Br. brevis с использованием бактериологического анализатора Vitek-2 Compac

  № п/п	Тесты	Изученные штаммы
  		Вacillus mucilaginosus № 1	Вacillus mucilaginosus № 2	Brevibacterium brevis № 3	Контрольный штамм Bacillus sub-tilis 723
  Ферментативная активность
  1	Бета-ксилозидаза	+	-	-	+
  2	L-лизинариламидаза	-	+	-	-
  3	L-аспартатариламидаза	-	+	+	-
  4	Лейцинариламидаза	+	+	+	+
  5	Фенил аланинариламидаза	+	+	+	+
  6	L-пролинариламидаза	-	+	+	-
  7	Бета-галактозидаза	+	+	+	-
  8	L-пирролидонилариламидаза	+	-	+	+
  9	Альфа-галактозидаза	-	-	-	+
  10	Аланинариламидаза	-	+	-	-
  11	Тирозинариламидаза	+	+	+	+
  12	Бета-N-ацетил-глюкозаминидаза	-	-	-	-
  13	Ala-phe-ргоариламидаза	-	+	+	-
  14	Альфа-маннозидаза	-	-	-	-
  15	Мальтотриоза	+	+	-	-
  16	Глицинариламидаза	+	+	+	+
  17	Бета-глюкозидаза	+	+	-	+
  18	Бета-маннозидаза	-	-	-	-
  19	Альфа-глюкозидаза	+	-	-	-
  20	Путресцин, ассимиляция	+	-	-	-
  21	Тетразолий красный	+	+	-	-
  Утилизация углеводов
  22	Циклодекстрин	-	-	-	-
  23	D-галактоза	+	+	+	-
  24	Гликоген	-	-	-	-
  25	Мио-инозитол	+	+	-	-
  26	Еллман	+	+	-	+
  27	Метил-р-ксилоза	-	-	-	-
  28	D-маннит	+	+	+	-
  29	D-манноза	+	+	-	-
  30	D-мелецитоза	-	-	-	-
  31	N-ацетил-D-глюкозамин	+	+	-	-
  32	Палатиноза	+	-	-	-
  33	L-рамноза	+	+	-	-
  34	Пируват	+	+	-	-
  35	D-тагатоза	+	-	-	-
  36	D-трегалоза	+	+	-	-
  37	Инулин	-	-	-	-
  38	D-глюкоза	+	+	-	+
  39	D-рибоза	+	+	-	+
  40	Эскулин, гидролиз	+	+	-	+
  41	Метил-а-D-глюкопиранозид, подкисление	+	-	+	-
  42	Фосфорилхолин	-	+	+	-
  Устойчивость к антибиотикам
  43	Устойчивость к канамицину	-	+	+	+
  44	Устойчивость к олеандомицину	-	+	+	-
  45	Устойчивость к полимиксину В	+	-	+	-
  Ингибирование роста
  46 \	Рост при 6.5% NaCI                    1	+                 1	- 1	- 1	+

Выводы

• 1.    Из кишечника калифорнийского червя, его копролитов и биогумуса изолированы два штамма В. mucilaginosus и один штамм Br. brevis.

• 2.    Наибольшей биохимической активностью, по результатам классического бактериологического и приборного анализов, обладают штаммы В. mucilaginosus № 1 и 2, что позволяет рекомендовать их к использованию в качестве компонента биоудобрения в сельском хозяйстве.

• 3.    Подтверждена способность бревибактерий Br. brevis синтезировать ГМФ из гуанина.