Изучение показателей, характеризующих митохондриальную дисфункцию у коров при воздействии стресс-факторов

Введение. Многочисленными исследованиями было установлено, что при технологическом стрессе у коров усиливаются процессы свободно-радикального окисления, включая процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), и снижается активность антиоксидантной системы крови [1, 2].

При активации ПОЛ происходит интенсивный распад фосфолипидов мембран клеток и митохондрий, включая фосфолипид внутренней мембраны митохондрий - кардиолипин, в следствие чего увеличивается проницаемость этих мембран и повышается уровень внутриклеточного и внутримитохондриаль-ного кальция.

The article presents the results of research of biochemical parameters confirming mitochondrial dysfunction in cows, which continue for 21 days under the sensitized effect of the stress factors accompanying the technology, and diagnosing the state of adaptive stress (in terms of MDA, cortisol, and cortisol/insulin ratio). The work was performed in the period from 2018 to 2024 on the basis of the industrial complex of OOO "Maslovo" and in the laboratory conditions of the Department of Biotechnology and Chemistry named after Professor N.E. Pavlovskaya and in the conditions of the INIC of the Oryol State Agrarian University named after N.V. Pa-rakhina. The object of the research was Holstein cows kept in stressful conditions of the industrial complex of OOO "Maslovo". The authors studied malondialdehyde (MDA) as an indicator used to diagnose mitochondrial dysfunction. Thus, during the 21st day of the research, a significantly increased level of MDA was observed in the blood serum of cows (5.4-9.5 times higher than normal) and a decrease in the content of ceruloplasmin relative to the reference values (by 0.12-0.79 mmol/l). The state of tension (stress) was determined by the cortisol/insulin index, which by the 21st day of the research was 1.11± 0.11, which corresponds to a high state of tension and a low adaptive reserve in the cows studied.

Окислительное повреждение митохондриального кардиолипина и нарушения в метаболизме кальция активизируют открытие митохондриальных пор неспецифической проницаемости, что приводит к набуханию митохондрий, к еще большему повреждению митохондриальных мембран и гибели клеток [3, 4].

Для обеспечения синтеза АТФ необходимым условием является целостность внутренних мембран митохондрий. Интенсивность процессов синтеза АТФ определяется как энергетический статус клетки [5].

Живой многоклеточный организм, в том числе и организм коров, представляет собой единую энергетическую систему, суммированную из энергетических потенциалов всех клеток [6].

Нарушения в энергообразующих процессах клетки, в том числе вызванных усилением свободнорадикального окисления (СРО) приводит к развитию митохондриальной дисфункции [3, 7]. Митохондриальной дисфункцией называется патологический процесс, не зависящий от этиологии и протекания заболевания, проявляющийся, в первую очередь, нарушением энергообразующей функции митохондрий [1, 3]. Энергетический обмен является основой для функционирования всех органов и систем в организме, поэтому нарушения в нем провоцируют развитие патологических процессов [8].

Самыми распространенными заболеваниями у высокопродуктивных коров являются болезни неинфекционной этиологии, в частности заболевания, возникающие в том числе за счет развития митохондриальной дисфункции на фоне окислительного стресса у коров, в следствие чего происходит нарушение баланса между процессом синтеза молока и внутренними резервами организма для обеспечения метаболического гомеостаза [9].

Отел и транзитный период у коров сопровождается гормональной перестройкой и увеличением потребности в пластических и энергетических веществах. В отмеченные периоды происходит смена условий содержания и кормления, что в итоге приводит к чрезмерному напряжению процессов обмена у животных и повышению чувствительности к воздействию стресс-факторов [2, 10, 11].

На данный момент для диагностики митохондриальной дисфункции не существует стандартного набора методов и показателей [4]. Одним из маркеров, используемых при выявлении митохондриальной дисфункции, считается малоновый диальдегид (МДА). Малоновый диальдегид считается общепризнанным показателем окислительного стресса и перекисного окисления липидов [3]. При окислительном повреждении липидов, ДНК и аминокислот накапливается МДА, который инактивирует митохондриальные комплексы I, II и V и негативно влияет на функциональность митохондрий [12].

Особое внимание в современном промышленном животноводстве уделяется разработке и применению методов, направленных на снижение стресс-нагрузки на сельскохозяйственных животных [13]. Однако, согласно анализу литературных данных, отрицательное влияние существующих при данной технологии стресс-факторов остается высоким, в том числе и за счет эффекта сенсибилизации, т.е. повышения чувствительности организма к воздействию последующих стрессоров [13, 14]. Поэтому считаем, что одним из важных путей минимизации влияния стресс-факторов на коров является повышение функциональных резервов организма, в том числе за счет коррекции нарушений при окислительном стрессе и митохондриальной дисфункции.

Для разработки способов коррекции митохондриальной дисфункции у коров в условиях промышленного комплекса актуальным является диагностика и определение степени выраженности данной патологии.

Целью исследований являлось выявление митохондриальной дисфункции у коров стрессогенного промышленного содержания и наблюдение за тенденцией ее сохранения на протяжении 21 дня под сенсибилизированным действием сопровождающих стресс-факторов и изучение взаимозависимости данной патологии с состоянием оксидантно-антиоксидантного и гормонального статусов у животных, а также анализ показателей продуктивности исследуемых коров на фоне установленных адаптационных нарушений.

Условия, материалы и методы. Исследования были выполнены в период с 2018 по 2024 гг. на базе промышленного комплекса ООО «Маслово», в лабораториях кафедры биотехнологии и химии имени профессора Н.Е. Павловской и в условиях инновационного научно-исследовательского испытательного центра ФГБОУ ВО Орловский ГАУ им. Н.В. Парахина.

Объектом эксперимента являлись коровы голштинизированной породы, содержащиеся в стрессогенных условиях промышленного комплекса ООО «Маслово».

В качестве материала для исследований использовали сыворотку крови. Кровь для исследований отбирали в утренние часы перед кормлением из яремной вены у коров, соблюдая все правила асептики и антисептики [15].

Для выявления митохондриальной дисфункции и оксидантного статуса у коров определяли содержание малонового диальдегида в сыворотке крови методом Э.Н. Коробейниковой (1989) по реакции с тиобарби-туровой кислотой.

Оценку антиоксидантного статуса проводили по показателю церулоплазмина (ЦП), как основного антиоксиданта плазмы крови, с помощью экспресс-метода по Э.В. Тэну (1981).

Состояние гормонального статуса оценивали по уровням кортизола и инсулина. Данные гормоны совместно с еще некоторыми другими гормонами обеспечивают энергетический гомеостаз, являющийся ключевой составляющей для обеспечения высокой молочной продуктивности у коров. Также исследовали соотношение кортизола к инсулину, как степень выраженности напряжения в организме и резерв его компенсаторных возможностей [16].

Массовую долю жира и массовую долю белка определяли с помощью ультразвукового анализатора «Лактан 1-4» (Россия).

Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны и представлены в статье в виде M±SD, где М - среднее арифметическое, SD -среднеквадратичное отклонение. Достоверность отличий между средними величинами в разных группах исследования устанавливали с помощью критерия Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждения. У исследуемых коров, содержащихся в условиях промышленного комплекса, был установлен окислительный стресс, что подтверждалось значительным увеличением содержания в сыворотке крови малонового диальдегида и снижением уровня церулоплазмина относительно нормальных значений (см. рис. 1).

Рис. 1 - Показатели оксидантно-антиоксидантного статуса у высокопродуктивных коров при технологическом стрессе в течение 21 дня, (ООО «Маслово»)

Концентрация малонового диальдегида в крови коров была выше относительно верхней (0,4 мкмоль/л) и нижней (0,3 мкмоль/л) границ нормы соответственно: в 1 день исследования - в 5,4 раза и в 7,2 раза, на 8-й день - в 5,6 раза и 7,5 раза, на 16-й день - в 5,5 раза и в 7,3 раза, к 21-му дню - в 7,2 раза и в 9,5 раза.

Диагностированный нами повышенный уровень малонового диальдегида на протяжении всего исследования свидетельствует о наличии митохондриальной дисфункции у коров.

Митохондриальная дисфункция сопровождалась низким уровнем церулоплазмина в крови коров отно- сительно верхней (1,84 мкмоль/л) и нижней (1,6 мкмоль/л) границ нормы, соответственно: в 1 день уровень был ниже на 0,12 мкмоль/л и на 0,58 мкмоль/л, на 8-ой день - на 0,25 и 0,71 мкмоль/л, на 16-й день - на 0,26 мкмоль/л и на 0,72 мкмоль/л, к 21му дню - на 0,33 и 0,79 мкмоль/л.

Окислительный стресс у высокопродуктивных коров в стрессогенных условиях промышленного комплекса протекал на фоне нарушений гормонального статуса (по уровню кортизола и инсулина) (см. рис. 2).

Рис. 2 - Динамика уровней кортизола и инсулина в крови высокопродуктивных коров при технологическом стрессе в течение 21 дня, (ООО «Маслово»)

К концу исследования (к 21-му дню) уровень кортизола в сыворотке крови коров приближался к верхней границе референса и составил 88,1±3,2 нмоль/л при норме 26-90 нмоль/л. Инсулин находился в пределах нормальных значений (2-20 мМЕ/л) и к 21му дню составил 13,1±1,21 мМЕ/л. При этом было установлено, что концентрация глюкозы в сыворотке крови у коров была ниже нормальных значений весь период исследования и к 21-му дню составила 2,2±1,22 ммоль/л при норме 2,5-4,1 ммоль/л.

Анализ научной литературы показывает, что гормональная реакция организма на воздействие стресс-факторов может меняться, и в связи с чем уровень стресса (напряжения) следует выявлять не по количеству глюкокортикоидов и инсулина, а по их соотношению - по индексу кортизол/инсулин. Установлено, что высокое соотношение кортизола к инсу- лину отражает более сильное напряжение и меньший адаптационный резерв [17, 18].

Согласно исследованиям Алексанина С.С. соотношение кортизол/инсулин у исследуемых животных оценивали по отношению к медиане, которая рассчитывалась как частное медиан диапазонов нормальных значений для кортизола (в нмоль/л) и инсулина (в пмоль/л), и составила 0,6 [14, 1 7]. К 21-му дню исследования индекс кортизол/инсулин составил 1,11±0,11, что в 2 раза (p<0,05) превышало медиану, рассчитанную на основе диапазонов нормы данных гормонов (см. рис. 3). Определение индекса кортизол/инсулин, как показателя стресса, позволило установить, что исследуемые коровы находились в состоянии напряжения, и у них отмечалось снижение адаптационных возможностей.

Кортизол/инсулинх 103

Рис. 3 -Динамика изменения соотношения кортизола к инсулину в крови высокопродуктивных коров при технологическом стрессе в течение 21 дня, (ООО «Маслово»)

Установленные нами нарушения в оксидантноантиоксидантном и гормональном статусах и их взаимозависимости с митохондриальной дисфункцией сопровождались низкой молочной продуктивностью у коров. К 21-м суткам исследований среднесуточный удой составил 23,1±0,42 кг (низкий удой) при норме (средний удой) 31 кг, массовая доля белка и жира составили 3,16±0,04 и 3,49±0,09%, соответственно [19].

Важным показателем состояния организма животного является молочная продуктивность. Нарушения в метаболических и энергетических процессах у коров являются препятствием для реализации их генетически детерминированного потенциала молочной продуктивности. В основном, причины возникновения данных патологий заключаются в погрешностях в кормлении, в не соответствующих условиях содержания и хозяйственного использования высокопродук- тивных коров. Метаболические и энергетические нарушения необходимо устранять с помощью корректирующих средств желательно природного происхождения, что позволит оптимизировать обмен веществ и увеличить молочную продуктивность.

Выводы. У исследуемых коров выявлена митохондриальная дисфункция, которая сохранялась на протяжении 21 дня под сенсибилизированным действием сопровождающих технологию стресс-факторов, было диагностировано состояние адаптационного напряжения, что подтвердилось увеличением свободно-радикального окисления (по уровню МДА), содержанием стрессовых гормонов и их соотношением. Установленные патологические изменения рассматриваются нами как причина метаболических нарушений и низкой продуктивности у обследованных коров.