Изучение полиморфных вариантов гена рецептора серотонина типа 2А 5-HTR2A при пограничных психических расстройствах

STUDY OF POLYMORPHIC VARIANTS OF SEROTONIN RECEPTOR GENE 2А 5-HTR2A IN BORDERLINE MENTAL DISORDERS. L. A. Ryadovaya¹, E. V. Gutkevich¹, O. M. Lavrushina², S. A. Ivanova¹, V. Ya. Semke¹. ¹Tomsk, SI Mental Health Research institute TSC SB RAMSci; ² Moscow, SI Scientific Mental Health Center of RAMSci. A b s tr a c t : Patients with dissociative (conversion) disorders (46 persons), patients with adjustment disorders (36 persons) and mentally healthy persons (85 persons) were investigated. Polymorphic variants of a gene of serotonin’s receptor of type 2А (5-HTR2A) were studied. Authentic distinctions and distinctions at a level of the tendency between distribution of genotypes of locus Т102С and A-1438-G among patients and mentally healthy people were revealed, that, probably, testify to the contribution of polymorphic locus of a gene 5-HTR2A in development of neurotic mental disorders.

В настоящее время психические расстройства рассматривают как мультифакториальные заболевания с полигенным механизмом наследования, в причинную цепь возникновения и развития которых входят как генетические факторы, так и факторы внешней и внутренней среды индивида, включая и особенности его психологического реагирования. В развитие мультифакториальных заболеваний вовлечены генетические полиморфизмы, которые могут как препятствовать, так и располагать к проявлению заболеваний. Их неблагоприятное действие проявляется либо по достижению сочетания «неудачных» аллелей и/или в действии провоцирующих внешних факторов (Todd J. A. et al., 1988). Гены, аллельные варианты кото- рых предрасполагают к определенным заболеваниям, называют генами предрасположенности (Баранов В. С. и др., 2000). Наследственная предрасположенность к психическим расстройствам не подразумевает передачу потомству болезни как таковой, а предполагает передачу лишь ряда признаков, определяющих высокую вероятность развития этих заболеваний. В большинстве случаев мультифакториальные заболевания сопровождаются изменением фенотипа в результате нарушения экспрессии различных генов или их мутации. В каждой из генных сетей выделяют главные (центральные) гены, координирующие функции остальных элементов, и дополнительные (вспомогательные, гены-модификаторы), которые ускоряют и углубляют патологический процесс. В развитие наиболее распространенных мультифактори-альных заболеваний вовлечено два и более генов, фенотипически изменяющихся под влиянием многочисленных триггерных факторов внешней среды (Пономаренко Г. Н., 2005). Генетические варианты полиморфных локусов генов, преимущественно тех, которые участвуют в метаболизме нейромедиаторов, ассоциированы с психическими расстройствами, а также связаны с их фенотипическими признаками – клиническими, психологическими, нейрофизиологическими. Однако молекулярногенетических исследований полиморфизмов гена серотонинового рецептора типа 2А при непсихотических (пограничных) психических расстройств не проводилось, что делает настоящую работу актуальной.

Целью проводимого исследования являлось изучение полиморфных вариантов локусов T102C и A-1438-G гена 5-HTR2A у больных пограничными психическими расстройствами и психически здоровых людей.

Материал и методы. Исследование проводили в группе пациентов с истерическими расстройствами невротического уровня (46 человек, из них 9 мужчин и 37 женщин, средний возраст 41,3±14,3 года), больных с расстройствами адаптации с преобладанием депрессивных реакций (36 человек, из которых 3 мужчин и 33 женщины, средний возраст 42±13,1 года) и в группе психически здоровых лиц (85 человек, из них 17 мужчин и 68 женщин, средний возраст 38,8±13,8 года).

Выделение ДНК из венозной крови проводили стандартными методами с использованием протеиназы К и фенол-хлороформа (Sam-brook J. et al., 1989). Для определения аллельного полиморфизма в локусе Т102С проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием следующих олигонуклеотидных праймеров: 5’-TCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3’ и 5’-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3’. ПЦР проводили в 15 мкл реакционной смеси следующего состава: 10-кратный буфер для ПЦР [160 mM (NH4)2SO4, 670 mM трис HCl (pH 8.8), 0,1 % Tween-20]; 15 мМ раствора хлорида магния; 0,2 мМ смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов dNTP; 10 рМ каждого праймера; 0,5 ед. Taq ДНК-полимеразы («МЕДИГЕН», Новосибирск) и до 100 нг геномной ДНК. После денатурации в течение 2 минут при 94,5°С проводили 30 циклов амплификации по следующей схеме: 94,5°С – 30 секунд, 60°С – 30 секунд, 72°С – 35 секунд. Достройку цепи проводили при 72°С в течение 4 минут, после чего пробы хранили при температуре 10—20°С. ПЦР-продукт представлен фрагментом ДНК 342 пары оснований (п.о.). Для проведения аллельного Msp1 рестрикционного полиморфизма 12,5 мкл ПЦР смеси инкубировали с ферментом Msp1 (1—2 о.е. на пробу) в течение 12 часов при 37°С с последующим разделением полученных фрагментов в 3-процентном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием.

Фрагменты визуализировали в УФ-свете при длине волны 495 нм и идентифицировали в соответствии со стандартными фрагментами маркера рUC19/Msp-I («СибЭнзим», Новосибирск). Для анализа полиморфизма A-1438-G в реакционную смесь вносили по 10 рМ праймеров со следующей последовательностью нуклеотидов: 5’-AAGCTGCAAGGTAGCAACAGC-3’ и 5’-AACCAACTTATTTCCTACCAC-3’. Проводили 30 циклов ПЦР по следующей программе: 94,5°С – 30 секунд, 59°С – 35 секунд, 72°С – 30 секунд. Для выявления полиморфизма реакционную смесь обрабатывали рестриктазой Msp1 в течение 12 часов при 37°С. Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 3-процентном агарозном геле, окрашенном этидием бромида, и идентифицировали в УФ-свете. Статистическую обработку результатов производили с помощью программ «Microsoft Excel» и «GraphPad Prism» (версия 5,0).

Результаты и обсуждение. В результате генотипирования по локусу Т102С ДНК каждого обследуемого была представлена одним из следующих вариантов: 1) фрагментом 342 п. о. – в этом случае материнский и отцовский аллели не имели нуклеотидной замены (генотип А1А1); 2) фрагментами 342, 216 и 126 п. о. – один из аллелей имел нуклеотидную замену (генотип А1А2); 3) фрагментами 216 и 126 п. о. – оба аллеля имели нуклеотидную замену (генотип А2А2). Msp1 полиморфизм локуса A-1438-G представлен следующими генотипами: АА – фрагменты 468 п. о., AG – фрагменты 468 п. о., 244 и 224 п. о., GG – фрагменты 244 и 224 п. о.

Статистический анализ выявил достоверные различия между распределением генотипов А1А1 и А1А2 локуса Т102С гена 5-HTR2A у пациентов с расстройствами адаптации в сравне- нии с контрольной группой (χ²=4,26; df=1; р=0,04). Частоты генотипов А1А1 и А1А2 данного локуса среди пациентов с истерическими расстройствами не отличаются от контрольного распределения (χ²=0,04; df=1; р=0,8). Отмечена тенденция различий распределения гомозиготных генотипов А1А1 и А2А2 локуса Т102С среди пациентов с расстройствами адаптации и контрольной группой (χ²=2,2; df=1; р=0,14).

Таблица

Частоты генотипов полиморфных локусов Т102С и A-1438-G гена 5-HTR2A (абс., %)

Примечание. * – Достоверность различий по отношению к контролю (p<0,05).

Распределение гомозиготных генотипов AA и GG локуса A-1438-G среди больных с истерическими расстройствами отличается от распределения соответствующих генотипов в контрольной группе на уровне тенденции (χ²=2,9; df=1; р=0,086). Частоты AA и GG у пациентов с расстройствами адаптации статистически не отличаются от данных показателей психически здоровых лиц (χ²=0,8; df=1; р=0,37). Распределение генотипов AA и AG локуса A-1438-G гена 5-HTR2A среди пациентов с истерическими расстройствами и расстройствами адаптации статистически не отличается от частот генотипов психически здоровых людей (χ²=0,08; df=1; р=0,77 и χ²=0,001; df=1; р=0,97, соответственно). Различия между частотами генотипов AG и GG данного локуса у пациентов с истерическими расстройствами и психически здоровых лиц выявлены на уровне тенденции (χ²=2,7; df=1; р=0,097). Различия между распределением генотипов AG и GG локуса A-1438-G среди пациентов с расстройствами адаптации и психически здоровых лиц не достигают уровня статистической значимости (χ²=0,66; df=1; р=0,41).

Известно, что серотониновый обмен оказывает определенное влияние на поведение млекопитающих, включая человека (Lucki I., 1998). Серотониновые рецепторы типа 2А, регулирующие уровень 5-НТ в мозге, в значительных количествах содержатся в структурах, связанных с эмоциональными и когнитивными процессами, в гиппокампе и передней коре головного мозга. Обнаружено снижение их экспрессии в височной коре, гиппокампе и префронтальной области при шизофрении (Hernandez I., Sokolov B. P., 2000). Показана также способ- ность этих рецепторов связывать некоторые антипсихотические препараты, которые замедляют у больных шизофренией развитие негативной симптоматики (Arranz M. J. et al., 1998). В гене серотонинового рецептора типа 2А (5-HTR2A), расположенном на 13-й хромосоме, описано несколько полиморфных локусов. Локус Т102С обусловлен заменой тимина на цитозин во втором интроне участка 13q 14-21 и представлен двумя аллельными вариантами: А1 и А2. Второй полиморфный локус гена 5-HTR2A (локус A-1438-G) представлен аллелями A и G, этот локус находится в неравновесном генетическом сцеплении с локусом Т102С и расположен в зоне промотора гена, т. е. может иметь функциональное значение. Полиморфные варианты гена серотонинового рецептора типа 2А (5-HTR2A) связаны с клинической гетерогенностью шизофрении и заболеваниями шизофренического спектра (Лаврушина О. М. и др., 2005). Генотип А2А2 локуса Т102С значимо чаще встречается у больных с хронической формой течения шизофрении, для которой характерны значительная степень выраженности негативной симптоматики, раннее начало и наследственная отягощенность по шизофрении (Орлова В. А., 2000). Генотип А2А2 связан с проявлением определенной совокупности психологических и нейрофизиологических признаков у больных эндогенными психозами, в частности, с сужением диапазона эмоциональных реакций, тенденцией к уменьшению продуктивности речевых ассоциаций и высоким болевым порогом у больных шизофренией и сужением диапазона эмоциональных реакций у пациентов с аффективными расстройствами (Голимбет В. Е., 2003). Показана ассоциация аллеля А2 гена 5-HTR2A с алкоголизмом, отягощенным асоциальным поведением (Hwu H. G., Chen C. H., 1997), паническими расстройствами (Inayama Y. et al., 1996) и поздними дискинезиями (Macciardi F. et al., 1997). Описаны ассоциации между аллелем G локуса A-1438-G и сезонными аффективными психозами (Enoch M. A. et al., 1999), а также с независимым от алкоголь-дегидрогиназы алкоголизмом у лиц японской национальности (Kouzmenko A. P. et al., 1999). У больных шизофренией с поздними дискинезиями обнаружено значимое преобладание частот аллеля G (Segman R. H. et al., 2001). У больных с семейными случаями шизофрении отмечается увеличение частоты генотипа GG (Митюшина Н. Г. и др., 2003). Выявлено дозозависимое влияние аллеля Т102С гена 5-HTR2A на опосредованную память и коммуникативные навыки у психически здоровых лиц и на кратковременную память у больных шизофренией (Алфимова М. В., 2006). Аллели А2 и G гена 5-HTR2A связаны с проявлениями шизотипиче- ских черт личности у психически здоровых лиц (Митюшина Н.Г. и др., 2003).

Наследственная предрасположенность играет значительную роль в формировании психических расстройств, факторы социальной среды определяют факт возникновения психической дезадаптации, а форма реагирования, психопатологическая картина и течение заболевания определяются патологическим генотипом. Выявленные различия между распределением генотипов локусов Т102С и A-1438-G гена 5-HTR2A среди пациентов с расстройствами адаптации и истерическими расстройствами и психически здоровых людей, возможно, свидетельствуют о вкладе полиморфных локусов гена рецептора серотонина типа 2А в развитие невротических психических расстройств. Полученные данные должны найти применение в клинических условиях, прежде всего в аспекте установления патогенетических биологических и социальных факторов, дифференциальной диагностике психических расстройств, а также критериев выбора методов сочетанной терапии и профилактики с участием биологов и клиницистов.