Изучение пробиотического потенциала штаммов молочнокислых бактерий Latilactobacillus sakei

Ферментированные продукты из рыбы пользуются высоким потребительским спросом во всем мире. Их ассортимент достаточно широк и представлен продуктами различных наименований, в том числе пастами и соусами [1, 5, 7, 9, 13].

В последние годы ферментация с использованием пробиотических микроорганизмов, в том числе молочнокислых бактерий, широко применяется для разработки новых технологий рыбных продуктов. Например, применение Lactococcus lactis M10 и Weissella cibaria M3 позволило сократить продолжительность ферментации и улучшить качество традиционного китайского ферментированного рыбного продукта Chouguiyu [1].

В работе B. Speranza и др. проводится выбор бактериальных стартовых культур для производства ферментированного рыбного соуса. В результате были отобраны штаммы, которые позволяют сократить продолжительность ферментации и улучшить микробиологические показатели готового продукта [11].

Известно также исследование ученых из Тайланда, которые использовали для ферментации рыбы бактериальную стартовую культуру, состоящую из Lactiplantibacillus plantarum IFRPD P15 и Limosilactobacillus reuteri IFRPD P17. Это позволило сократить время ферментации и улучшить показатели безопасности продукта в связи с тем, что применяемые бактерии обладают активностью против патогенной микрофлоры [7].

Большой интерес представляет применение молочнокислых бактерий для создания рыбных продуктов с пробиотическими свойствами.

В связи с вышеизложенным важным направлением развития пищевой промышленно- сти является поиск новых бактериальных штаммов, предназначенных для использования в качестве стартовых культур для ферментированных рыбных продуктов [1, 5, 7, 11].

При создании новых бактериальных препаратов для пищевой промышленности должен проводиться учет биохимической активности и влияния стрессовых факторов на рост применяемых штаммов [10, 14].

Ценность штаммов определяется способностью сохранять высокую биохимическую активность, зависящую от внешних факторов и от соотношения между биохимически активными и неактивными клетками в популяциях микроорганизмов [14].

Известно, что молочнокислые бактерии обладают развитыми механизмами защиты от стрессовых факторов, которые позволяют им выживать в суровых условиях. Эти механизмы зависят от многих факторов [2–4, 6, 8].

Таким образом, целью работы является изучение пробиотических свойств штаммов молочнокислых бактерий Latilactobacillus sakei LSK-45 и Latilactobacillus sakei DSM 20017, предназначенных для использования в составе бактериальных препаратов для рыбоперерабатывающей промышленности.

Объекты и методы исследований

Объектами экспериментальных исследований служили два штамма молочнокислых бактерий вида Latilactobacillus sakei (Katagiri et al. 1934) Zheng et al. 2020):

– Latilactobacillus sakei LSK-45,

– Latilactobacillus sakei DSM 20017.

Оба штамма были получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИгенетика.

При проведении экспериментальных исследований молочнокислые бактерии культивировали на полужидкой среде MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) (ООО «НПЦ «Биокомпас-С») при оптимальной температуре, равной 37 °С.

Количественный учет молочнокислых микроорганизмов проводили методом предельных разведений на агаризованной среде MRS (ООО «НПЦ «Биокомпас-С»).

Для изучения морфологии клеток из колоний изучаемых штаммов готовили фиксированные бактериальные препараты, окрашивали их по Граму и микроскопировали с применением микроскопа Микмед-6 (ЛОМО, Россия).

Для оценки пробиотических свойств штаммов изучали их устойчивость к воздействию опасных факторов среды, в том числе активной кислотности, желчи, фенола.

Активную кислотность (рН) питательной среды определяли при помощи рН-метра Анион-4100 (ООО НПП «Инфраспак-Ана-лит», Россия).

Толерантность изучаемых штаммов к желчи оценивали по количеству жизнеспособных клеток. При этом предварительно в питательную среду с содержанием желчи 0; 20 и 40 % вносили инокулят бактерий, затем питательную среду инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч, проводили количественный учет жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий.

Оценку толерантности бактерий к высоким и низким значениям рН проводили при значениях рН питательной среды, равных 3,5 и 8,3.

Толерантность бактерий к фенолу определяли после его культивирования в течение 24 ч при 37 °С в питательной среде с содержанием фенола 0,4 %.

Результаты и их обсуждение

На первом этапе проводили анализ характеристик, полученных из паспортов штаммов. Известно, что штамм Latilactobacillus sakei LSK-45 был получен из конской колбасы. Штамм обладает антагонистической активностью против Escherichia coli , Proteus vulgaris , Salmonella typhimurium .

Штамм Latilactobacillus sakei DSM 20017 является типовым штаммом вида и был выделен из традиционного японского алкогольного напитка саке.

Известно, что бактерии вида Latilacto-bacillus sakei хорошо адаптированы к росту в мясе и рыбе, способны развиваться при низких положительных температурах [12]. Ранее проведенными исследованиями установлено, что изучаемые штаммы являются толерантными к высоким концентрациям соли (6– 10 %), причем большей толерантностью обладает штамм Latilactobacillus sakei LSK-45 [15]. Эти свойства свидетельствуют о том, что бактерии вида Latilactobacillus sakei могут применяться при ферментации рыбы.

В результате анализа морфологии штаммов установлено, что особенностью штамма L. sakei LSK-45 является наличие коротких грамположительных палочек, которые расположены поодиночке, цепочками или группа- ми. Клетки штамма L. sakei DSM 20017 представляют собой грамположительные палочки, расположенные поодиночке, парами и цепочками (рис. 1).

а) L. sakei LSK-45

б) L. sakei DSM 20017

Рис. 1. Морфология штаммов Latilactobacillus sakei

На втором этапе изучали биохимическую активность штаммов, о которой судили по количеству жизнеспособных клеток и изменению рН при культивировании на среде MRS. Результаты исследований представлены на рис. 2.

Представленные данные показывают, что оба штамма обладают высокой активностью. Через 16 ч культивирования количество жизнеспособных клеток достигает 1010 КОЕ/см3, а затем остается на прежнем уровне. Снижение рН в процессе культивирования до значения 4,27 вызвано образованием в процессе ферментации молочной кислоты.

При разработке пищевых продуктов пробиотической направленности важное внима- ние уделяется количеству жизнеспособных клеток, которое должно составлять не менее 106 КОЕ/г. Однако известно, что в процессе изготовления и хранения продукта, а также в результате прохождения через желудочнокишечный тракт часть микроорганизмов погибает [14]. В связи этим на следующем этапе экспериментальных исследований оценивали влияние неблагоприятных факторов среды на рост изучаемых штаммов. Результаты представлены на рис. 3.

В результате исследований установлено, что изучаемые штаммы являются устойчивыми к желчи и фенолу, а также способны расти при низких и высоких значениях рН.

Большую устойчивость к высоким и низким значениям рН демонстрирует штамм L. sakei DSM 20017: при рН 3,5 выживаемость составляет 79,55 %, а при рН 8,3 – 92,02 %, тогда как выживаемость штамма L. sakei LSK-45 при рН 3,5 равна 66,63 %, а при рН 8,3 – 71,75 %, Возможно, это связано с происхождением штаммов, что подтверждается данными, приведенными в работе Sawatari и Yokota, в которой штаммы, выделенные из разных источников, отличались по устойчивости к высоким значениям рН [8].

Желчные кислоты играют важную роль в процессе пищеварения. Их присутствие в кишечнике оказывает угнетающее действие на микроорганизмы [12]. Полученные результаты показывают, что изучаемые штаммы являются устойчивыми к желчи: при 40 % желчи в среде выживаемость штаммов составляет более 50 %.

Устойчивость микроорганизмов к фенолу также изучается при оценке пробиотических свойств [10, 14]. В результате исследований установлено, что штаммы L. sakei LSK-45 и L. sakei DSM 20017 способны расти при содержании фенола 0,4 %, их выживаемость составляет 79,73 и 81,80 % соответственно.

Установлено, что изучаемые штаммы обладают высокой биохимической активностью и устойчивостью к действию неблагоприятных факторов, воспроизводящим условия желудочно-кишечного тракта. Таким образом, Latilactobacillus sakei LSK-45 и Latilacto-bacillus sakei DSM 20017 являются перспективными для применения в составе бактериальных препаратов для пищевой промышленности, применение которых позволит получить рыбные продукты, обладающие пробиотическими свойствами.

а)

—•—DSM 20017

б)

Рис. 2. Количество жизнеспособных клеток бактерий (а) и изменение рН (б) в процессе культивирования штаммов L. sakei LSK-45 и L. sakei DSM 20017 на среде MRS

■ DSM 20017 ■ LSK-45

Рис. 3. Выживаемость штаммов L. sakei при воздействии неблагоприятных факторов