Изучение роли полиморфизма генов репарации ДНК в формировании предрасположенности к развитию тройного негативного рака молочной железы у женщин

Acknowledgments : the work was carried out within the framework of the state assignment AAAA-A21-121011590009-9 “Immuno-hormonal interactions in breast cancer”.

Рак молочной железы (РМЖ) — наиболее распространенная злокачественная опухоль, возникающая у женщин и занимающая второе место в мировой статистике по смертности [Siegel et al., 2021; Злокачественные…, 2021]. Благодаря новым методам профилактики и лечения смертность из-за этого заболевания постепенно снижается. Данная злокачественная патология характеризуется высокой степенью гетерогенности и дополнительно подразделяется на несколько типов. Классификация РМЖ основана на экспрессии молекулярных маркеров. Тройной негативный рак характеризуется наихудшим прогнозом. Этот тип РМЖ встречается примерно у 15% пациенток. При этом на поверхности опухолевых клеток нет рецепторов эстрогена и прогестерона, а экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста (HER-2) нормальная. Это делает их крайне нечувствительными к терапии существующими на сегодняшний день препаратами, включая те, что целенаправленно действуют на HER-2 или гормональные препараты.

Согласно данным исследований известно, что РМЖ появляется в результате генетических и гормональных изменений, возникающих под действием факторов окружающей среды и профессиональной деятельности, тесно связан с неправильным образом жизни (употребление алкоголя и табака, лишний вес и ожирение, физическая инертность) и репродуктивной историей (возраст менархе, возраст первых родов, кормление грудью) [Sun et al., 2017; Obeagu, Obeagu, 2024]. Репарация ДНК является частью барьеров, защищающих от мутаций, увеличивающих риск онкопатологии [Torgovnick, Schumacher, 2015; Kur-furstova et al., 2016]. Репарация ДНК отвечает за поддержание целостности генома путем защиты клеток от генетических и экологически обусловленных нарушений. Гены, связанные с механизмами репарации ДНК, считаются генами-кандидатами предрасположенности к раку, поскольку нарушение механизмов поддержания целостности генома может привести к злокачественной трансформации [Rudolph, Chang-Claude, Schmidt, 2016]. Однако точные молекулярные механизмы развития рака молочной железы все еще находятся на стадии интенсивного изучения.

В нашем исследовании мы сосредоточились на оценке роли однонуклеотидных полиморфизмов генов (SNP) репарации ДНК в формировании наследственной предрасположенности к РМЖ у женщин, проживающих в промышленно развитом регионе. Основными задачами нашей работы было выявление активно изучаемых вариантов в генах репарации ДНК: APEX1 444T>G (rs1130409), ATM 5557G >A (Ars180151), hOGG1 977C>G (rs1052133), XPD 2251Т>G (rs13181), XPG 3310G>C (rs17655), ADPRT 2285 T>C (rs11610) у женщин Кемеровской обл. и оценка их эффектов относительно риска формирования онкопатологии. Результаты нашего исследования помогут наилучшим образом раскрыть молекулярную основу предрасположенности к РМЖ и лечь в основу профилактики данного типа рака.

Целью нашего исследования была оценка риска развития тройного негативного РМЖ у женщин Кемеровской обл. в соответствии с носительством полиморфных вариантов генов репарации ДНК.

Материалы и методы исследований

Были обследованы 682 женщины (русские по этнической принадлежности), проживающие на территории Кемеровской обл. РФ. От каждого человека было получено информированное согласие на участие в исследовании. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации: этические принципы проведения медицинских исследований с участием человека с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Министерством здравоохранения Российской Федерации 19.06.2003 г. Проведение исследования было утверждено комитетом по этике Института экологии человека Федерального исследовательского центра угля и углехимии СО РАН.

Группы формировались по принципу «случай–контроль» с учетом возраста, пола, этнической принадлежности и влияния факторов среды. Критерии включения: русские женщины, проживающие в Кемеровской обл. с момента рождения, возраст старше 40 лет. Критерии исключения: наличие наслед- ственных, аутоиммунных, аллергических, психических заболеваний, родственников с онкозаболеваниями, ранее диагностированный рак других органов. В первую группу вошли 217 впервые выявленных больных РМЖ (средний возраст 58.9±10.5). Диагноз РМЖ устанавливался по результатам клинического, эндоскопического и морфологического обследования на базе Кузбасского областного онкологического диспансера. Контрольную группу составили 465 не родственных женщин без онкозаболеваний в анамнезе, проживающих в той же местности (средний возраст 54.79±8.2). Все здоровые доноры, включенные в контрольную группу (онкопатология молочных желез была исключена по результатам маммографии и обследования у маммолога), не принимали препаратов с известным мутагенным действием и не проходили рентгенологических процедур в течение трех месяцев до участия в исследовании. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной методики фенольно-хлороформной экстракции [Sambrook, Fritsch, Maniatis, 1989]. После выделения клетки крови подвергались лизированию, белковая компонента разрушалась протеиназой К (SibEnzyme, Новосибирск, Российская Федерация). С учетом анализа данных литературы нами были выбраны полиморфные локусы генов APEX1 444T>G (rs1130409), ATM 5557G >A (Ars180151), hOGG1 977C>G (rs1052133), XPD 2251Т>G (rs13181), XPG 3310G>C (rs17655), ADPRT 2285 T>C (rs11610). Частота редкого аллеля в популяциях европеоидов учитывалась по данным доступного ресурса National Center for Biotechnology Information . Типирование полиморфных маркеров проводилось с помощью ал-лель-специфической ПЦР (ООО “Литех НПП”, Москва, Россия). Амплификацию проводили на термоциклере “Терцик” по программе, рекомендованной производителем наборов реагентов. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 3%-ном агарозном геле наличием бромистого этидия. Последующая визуализация фрагментов ДНК осуществлялась в камере с УФ-светом. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакетов прикладных программ: SNPstat , STATISTICA 10.0, MDR . Проводили оценку частоты аллелей и генотипов; анализировали соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга; оценивали статистическую значимость различий между группами по частотам аллелей и генотипов с учетом теста X2 на гомогенность выборок (статистически значимыми считали различия при p <0.05). Логистическую регрессию использовали для выявления ассоциации полиморфных локусов в различных моделях наследования (аддитивной, доминантной, сверхдоминантой, рецессивной, лог-аддитивной) c коррекцией на возраст, статус курения. Для выбора лучшей модели использовали информационный критерий Акайке (AIC). Исследование эффектов межгенных взаимодействий проводили в программе MDR – Multifactor Dimensionality Reduction .

Результаты

Частоты генотипов и аллелей исследованных полиморфных локусов показали соответствие равновесию Харди–Вайнберга как в группе больных РМЖ, так и в группе здоровых (табл. 1).

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных локусов генов репарации ДНК [The genotype and allele frequency distribution at the polymorphic DNA repair gene loci]

Локусы и генотипы	Генотипы и аллели	Больные РМЖ (Case)	Здоровые женщины (Control)	χ2	p
APEX1 444 T>G rs1130409	TT TG GG	80 (36.9%) 108 (49.8%) 29 (13.4%)	159 (34.3%) 232 (50.1%) 72 (15.6%)	0.54	0.69
	T/G	268(0.62)/166(0.38)	550(059)/376(0.41)
	p HWE	0.47	0.44
ATM 5557G >A Ars180151	GG GA AA	149 (73%) 46 (22.6%) 9 (4.4%)	352 (75.7%) 105 (22.6%) 8 (1.7%)	3.1	0.15
	G/A	344(0.84)/64(0.16)	809(0.87)/121(0.13)
	p HWE	0.6	1
hOGG1 977 C>G rs1052133	CC CG GG	130 (59.9%) 79 (36.4%) 8 (3.7%)	289 (62.8%) 147 (32%) 24 (5.2%)	1.3	0.4
	C/G	339(0.78)/95(0.22)	725(0.79)/195(0.21)
	p HWE	0.43	0.33

Окончание табл. 1

Локусы и генотипы	Генотипы и аллели	Больные РМЖ (Case)	Здоровые женщины (Control)	χ2	p
XPD 2251 T>G rs13181	TT TG GG	98 (45.2%) 93 (42.9%) 26 (12%)	211 (45.4%) 198 (42.6%) 56 (12%)	0.01	0.995
	T/G	289(0.67)/145(0.33)	620(0.67)/310(0.33)
	p HWE	0.65	0.4
XPG 3310 G>C rs17655	GG GC CC	72 (47.7%) 67 (44.4%) 12 (8%)	257 (60.8%) 147 (34.8%) 19 (4.5%)	7.4	0.015
	G/C	211(0.7)/91(0.3)	661(0.78)/185(0.22)
	p HWE	0.57	0.89
ADPRT 2285 T>C rs11610	TT TC CC	137 (70.6%) 50 (25.8%) 7 (3.6%)	309 (66.6%) 144 (31%) 11 (2.4%)	1.7	0.31
	A/C	324(0.84)/64(0.16)	762(0.82)/166(0.18)
	p HWE	0.43	0.27

Примечание. pHWE – значимость отличий распределения частот генотипов от равновесия Харди–Вайнберга (exact test for Hardy–Weinberg equilibrium); p – значимость отличий частоты встречаемости генотипа в группе больных и здоровых, критерий χ2 с поправкой Йетса.

При сравнении изученных групп жительниц Кемеровской области больных РМЖ и здоровых было выявлено отличие частот по вариантам гена XPG3310G>C ( rs17655 ).

Расчеты соотношения шансов для различных моделей наследования (табл. 2) показали, что для полиморфного варианта XPG 3310 G>C ассоциации с риском РМЖ наиболее значимо проявлялись в сверхдоминантной модели наследования в общей группе (ORadj = 0.64, 95% CI: 0.47-0.87; рadj = 0.004, AIC 657.3) и в лог-аддитивной модели в группе некурящих (ORadj = 0.68, 95% CI: 0.49-0.94; рadj = 0.019, AIC 552.2).

Таблица 2

Результаты анализа ассоциаций полиморфных локусов генов-кандидатов с риском РМЖ [Results of the analysis of polymorphic loci associations of candidate gene with the risk of breast cancer]

Локусы и генотипы	Группа	Модель	OR adj	p	AIC
APEX1	Общая	Лог-аддитивная	1.11 (0.87-1.41)	0.4	854.9
444 T>G	Курящие	Доминантная	2.49 (0.94-6.57)	0.064	111.3
rs1130409	Некурящие	Лог-аддитивная	1.20 (0.92-1.56)	0.18	695.9
ATM	Общая	Рецессивная	0.38 (0.14-1.00)	0.051	823.5
5557G >A	Курящие	Сверхдоминантная	0.76 (0.26-2.16)	0.6	110.5
Ars180151	Некурящие	Рецессивная	0.35 (0.12-1.03)	0.056	673.7
hOGG1	Общая	Сверхдоминантная	0.82 (0.58-1.15)	0.25	852
977 C>G	Курящие	Сверхдоминантная	0.61 (0.24-1.54)	0.3	113.6
rs1052133	Некурящие	Сверхдоминантная	0.86 (0.59-1.25)	0.43	694.5
XPD	Общая	Сверхдоминантная	0.99 (0.72-1.37)	0.96	857.2
2251 T>G	Курящие	Доминантная	0.30 (0.11-0.78)	0.011	108.2
rs13181	Некурящие	Доминантная	1.19 (0.83-1.70)	0.33	698.4
XPG	Общая	Лог-аддитивная	0.64 (0.47-0.87)	0.004	657.3
3310 G>C	Курящие	Доминантная	0.36 (0.11-1.14)	0.08	75.7
rs17655	Некурящие	Лог-аддитивная	0.68 (0.49-0.94)	0.019	552.2
ADPRT	Общая	Сверхдоминантная	1.30 (0.89-1.89)	0.17	800.2
2285 T>C	Курящие	Сверхдоминантная	3.55 (1.06-11.84)	0.27	97.6
rs11610	Некурящие	Рецессивная	0.61 (0.21-1.80)	0.38	659.9

Примечание. OR adj – показатель отношения шансов для редкого аллеля с поправкой на возраст. P – значимость различий между группами. AIC – критерий Акайке.

Для гена XPD2251 T>G наиболее значимые ассоциации проявлялись в доминантной модели наследования в группе пациентов, характеризующихся употреблением табачных изделий (ORadj = 0.30, 95% CI: 0.11-0.78 ; рadj =0.011, AIC 108.2).

Связи риска развития злокачественных новообразований молочной железы с полиморфизмами других генов системы репарации ДНК выявлено не было.

В результате анализа межгенных взаимодействий методом MDR были определены две треxлокусные модели, связанные с риском развития РМЖ у женщин (табл. 3).

Таблица 3

Анализ межгенных взаимодействий при формировании РМЖ у женщин [Analysis of intergenic interactions in the formation of breast cancer in women]

Сочетания полиморфных локусов в модели Tr. Bal. Acc. Test. Bal. Acc. Sign Test (P) Se Sp CVC Pre. модели

XPD 2251Т>G* APEX1444 T>G XPG 3310G>C (курящие)	0.8484	0.622	0.0001	0.9375	0.7381	10/10	0.5769
XPG 3310G>C* ATM5557G >A XPD 2251Т>G (некурящие)	0.6182	0.509	0.0001	0.5891	0.6398	8/10	0.3958

Примечание. Tr.Bal.Acc. – тренировочная сбалансированная точность; Test.Bal.Acc. – тестируемая сбалансированная точность; Sign Test – тест на значимость; Se – чувствительность; Sp – специфичность; CVС – повторяемость результата; Pre. (Precision) – точность модели; *алгоритм полного поиска (Exhaustive search algoritm).

Первая модель включала в себя полиморфизмы XPD 2251Т>G, APEX 1444 T>G и XPG 3310G>C. Кластерный анализ позволил установить тесное взаимодействие и взаимное усиление эффектов (синергизм) между полиморфными локусами XPD 2251Т>G и APEX1444 T>G, данный кластер взаимодействует с геном XPG 3310G>C с дублирующим эффектом.

Вторая модель ген-генного взаимодействия, ассоциированная с развитием РМЖ у некурящих женщин, включала полиморфные варианты генов XPG 3310G>C, ATM 5557G>A и XPD 2251Т>G. Выявлен кластер тесно взаимодействующих генов XPG 3310G>C и ATM 5557G>A , эффекты которых синонимичны. Данный кластер образовывал единый блок с геном XPD 2251Т>G с дублирующим эффектом данных генов (рис. 1).

XPG(3310G>C)

XPD(22511>G)

APEX1 (444T>G)

Модель 1. Курящие женщины

Модель 2. Некурящие женщины

Рис. 1. Дендрограмма межгенных взаимодействий у женщин больных РМЖ.

Короткие линии указывают на сильное взаимодействие генных локусов, длинные – на слабую связь; черным цветом указывается синергизм, т.е. взаимное усиление эффектов между локусами, серым– дублирование эффектов между локусами

[Dendrogram of intergenic interactions in women with breast cancer.

Short lines indicate strong interaction of gene loci, long lines indicate weak connection; black color indicates synergism, i.e. mutual enhancement of effects between loci, gray color indicates duplication of effects between loci]

Анализ комбинаций всех возможных вариантов модели в таблицах сопряженности позволил выявить 9 благоприятных и 9 негативных эффектов у курящих женщин и 10 благоприятных и 12 негативных у некурящих женщин комбинаций для развития тройного негативного РМЖ (рис. 2 и 3).

cc

XPD(2251DG)

GG        TG        TT

XPG(3310G>C) GC                               GG

XPD(22511>G)                         XPD(2251DG)

GG        TG        TT              GG        TG        TT

0xwd<

Рис. 2. Сочетания вариантов генов XPD 2251Т>G, APEX1444 T>G и XPG 3310G>C, указывающих на предрасположенность к возникновению онкозаболеваний молочной железы у курящих женщин.

Сочетания вариантов генов, указывающих на повышенный риск развития заболевания – темно-серые ячейки, на пониженный риск – светло-серые ячейки, отсутствующие сочетания генотипов – белые ячейки (столбики в ячейках слева – пациентки с РМЖ, правые – здоровые женщины)

[Combinations of gene variants XPD 2251T>G, APEX1444 T>G and XPG 3310G>C indicating a predisposition to breast cancer in women who smoke.

Combinations of gene variants indicating a high risk of developing the disease - dark gray cells, lower risk - light gray cells, missing combinations of genotypes - white cells (bars in the cells on the left - patients with breast cancer, on the right - healthy women]

AA

XPD(2251DG)

GG        TG        TT

ATM(5557G>A) GA                               GG

XPD(22511>G)                         XPD(2251DG)

GG        TG        TT              GG        TG        TT

(□ACDO 爾 adx

Рис. 3. Сочетания вариантов генов XPG 3310G>C, ATM 5557G >A и XPD 2251Т>G, указывающих на предрасположенность к возникновению онкозаболеваний молочной железы у некурящих женщин [Combinations of gene variants XPG 3310G>C, ATM 5557G>A and XPD 2251T>G indicating a predisposition to breast cancer in non-smoking women ]

Обсуждение

Рак молочной железы является наиболее распространенным злокачественным заболеванием у женщин. По оценкам GLOBOCAN 2020 каждая четвертая женщина страдает раком молочной железы, а каждая восьмая женщина умирает от рака молочной железы. Женщины старшего возраста имеют высокий уровень заболеваемости раком молочной железы. В 2018 г. 645 000 против 1–4 млн случаев рака молочной железы и 130 000 против 490 000 смертей были зарегистрированы в пременопаузальной и постменопаузальной группах соответственно [Sung et al., 2021]. В метааналитическом исследовании было отмече- но, что ранняя беременность и более длительное грудное вскармливание снижают ER (рецептор эстрогена) положительный и ER отрицательный риск развития рака молочной железы [Anstey et al., 2017; Fortner et al., 2019]. Поздний возраст вступления в брак и рождения ребенка приводит к недостаточной дифференциации тканей молочной железы, большему воздействию неэстрогенных мутагенов и генотоксичности эстрогенов, тем самым увеличивая риск РМЖ [Dey et al., 2009].

Кроме того, ожирение является еще одним сильным фактором риска развития рака молочной железы у женщин в постменопаузе, а также ассоциируется с плохим исходом заболевания у женщин всех возрастов [Picon‐Ruiz et al., 2017, Guo et al., 2018]. Также продолжает расти количество данных, что курение сигарет связано с повышенным риском развития рака молочной железы [Reynolds, 2013; Reiner et al., 2022]. В исследовании Gram показано, что женщины, которые курили более 5 лет до родов по сравнению с теми, кто никогда не курил, имели более высокий риск развития рака молочной железы в целом на 42% (95% CI: 1.13–1.78). [Gram et al., 2019].

Тройной негативный тип рака молочной железы представляет собой большой интерес для фундаментальных исследований генетики в виду его агрессивного течения. Его клетки характеризуются большим пролиферативным и метастатическим потенциалом в другие органы. Данный тип РМЖ может дополнительно подразделяться на другие подтипы, учитывая особенности экспрессии генов и молекул РНК, а также белков в составе опухолей. В итоге различают шесть подтипов: базальный 1-ого типа, базальный 2-ого типа, мезенхимальный, подтип подобный мезенхимальным стволовым клеткам, люминальный AR и иммунномодуляторный типы [Lehmann et al., 2011]. Тройной негативный тип возникает в 12–17% случаев у молодых женщин, которые также являются носителями мутаций в области генов BRCA . Его спорадическое формирование во многом определяется эпигенетическими изменениями в составе BRCA. В виду своего агрессивного течения, тройной негативный тип РМЖ более чувствителен к химиотерапии, что определяет наилучший прогноз лечения [Liedke et al., 2008]. В особенности наилучшую выживаемость среди пациентов обеспечивает неоадьювантная терапия.

В результате проведенного настоящего исследования были выявлены ассоциации между унаследованными вариантами ряда генов ферментов репарации ДНК и риском тройного негативного РМЖ. Была показана статистическая значимость вариантов гена XPG 3310G>C (rs17655 ) в общей и группе некурящих пациентов, и гена XPD 2251Т>G (rs13181 ) в группе курящих пациентов с риском формирования тройного негативного РМЖ у женщин, проживающих в промышленном регионе. По генам APEX1 444T>G (rs1130409), ATM 5557G >A (Ars180151), hOGG1 977C>G (rs1052133), ADPRT 2285 T>C (rs11610) статистически значимых ассоциаций выявлено не было.

Ген XPG кодирует белок, представляющий собой эндонуклеазу, которая вырезает поврежденный участок ДНК. XPG взаимодействует с комплексом TFIIH и обеспечивает прикрепление хеликаз для правильного разъединения цепей ДНК, делая их доступными для действия эндонуклеаз. Нарушение взаимодействия XPG–TFIIH приводит к диссоциации хеликаз и нарушению белкового комплекса, прерывая процесс репарации [Ito et al., 2007]. Adolf с соав. в своей работе показал, что генотип His/His XPG увеличивает риск РМЖ в 1.2 раза у молодых пациенток (<40 лет) (р = 0.028). Наличие генотипов Asp/His+His/His в 1.3 раза повышало риск развития РМЖ у пациенток с PR+ и в 1.1 раза снижало риск развития РМЖ у пациенток с люминальным-A типом РМЖ (p = 0.014, p = 0.020 соответственно) [Adolf et al., 2023]. Еще несколько ранее произведенных исследований также показали связь гена XPG с раком молочной железы [Na et al., 2015; Malik et al., 2018].

Ген XPD ( ERCC2 ) кодирует АТФ-независимую хеликазу. Это ключевой белок эксцизионной репарации нуклеотидов (NER), который узнает и исправляет различные мутации, образующиеся, например, после УФ-облучения или оксидативного стресса. В составе комплекса транскрипционных факторов (TFIIH) хеликаза XPD раскручивает цепь ДНК, обеспечивая доступ эндонуклеаз к поврежденному участку [Broughton, Steingrimsdottir, Lehmann, 1996]. Полиморфизм Lys751Gln (rs13181) является одним из наиболее широко изученных генетических маркеров XPD, и его роль в развитии рака очевидна [Ben-hamou, Sarasin, 2002]. В работах Smolarz с соав. генотип Gln/Gln гена XPD был связан с повышенным риском РМЖ и с тройным негативным РМЖ [Smolarz et al., 2014, 2019]. Samson и др. также сообщали, что генотип XPD Gln/Gln значительно связан с повышенным риском рака молочной железы у женщин Южной Индии [Samson et al., 2011]. Точно также Roberts с коллегами пришли к выводу, что варианты генов BER и NER могут влиять на риск развития рака молочной железы у человека [Roberts et al., 2011].

В рамках настоящего исследования проведено моделирование межгенных взаимодействий методом MDR. Для оценки межгенных взаимодействий с помощью MDR-анализа в отношении риска развития РМЖ у женщин использовали алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации исследованных полиморфных локусов. В результате анализа были выявлены наиболее информативные модели межгенных взаимодействий, детерминирующих формирование тройного негативного РМЖ у женщин: XPD 2251Т>G, APEX 1444 T>G, XPG 3310G>C и XPG 3310G>C, ATM 5557G>A, XPD 2251Т>G . Первая модель межгенных взаимодействий включала в себя гены XPD 2251Т>G, APEX 1444 T>G, XPG . Между генами XPD и APEX был выявлен сильный синергизм.

Ген XPG представляет собой локус с дублирующим эффектом. Вторую модель межгенных взаимодействий, связанную с развитием тройного негативного РМЖ у некурящих женщин, составили полиморфные локусы XPG 3310G>C, ATM 5557G>A, XPD 2251Т>G. Между генами XPG 3310G>C и ATM 5557G>A было выявлено взаимно усиливающее действие, а ген XPD 2251Т>G образовывал единый кластер с дублирующим эффектом данных генов.

Заключение

Подводя итог, можно сказать, что это исследование способствует раскрытию молекулярной основы тройного негативного рака молочной железы. Наши результаты указывают на гены репарации ДНК и их полиморфизмы, которые могут быть вовлечены в формирование рака молочной железы у женщин Кемеровской обл. Они могут найти практическое применение для улучшения диагностики рака на ранних стадиях развития и привести к снижению заболеваемости и смертности больных тройным негативным раком молочной железы.