Изучение сорбционной активности биосорбентов по отношению к Фумонизину В1

Микотоксины представляют собой сложные органические соединения, вырабатываемые в результате метаболических процессов нитчатыми грибами разных родов, например, Fusarium, Aspergillus и Penicillium [3, 7]. В настоящее время известно около 300 метаболитов, оказывающих неблагоприятное воздействие на живые организмы, включая животных и человека [13]. Наиболее важными классами микотоксинов, которые нежелательны в пищевых продуктах и кормах, являются афлатоксины, трихотецены, зеараленон, охратоксины и фумонизины. Большинство микотоксинов представляют серьезную опасность даже при очень низких концентрациях и, как сообщается, являются высокотоксичными и канцерогенными [6].

Загрязнение пищевых продуктов и кормов микотоксинами – серьезная глобальная проблема, которая приводит к значительным экономическим потерям [5]. Присутствие микотоксинов связано с грибковой инфекцией сельскохозяйственных культур, особенно наблюдаемой в отношении зерновых, например, кукурузы, ячменя, пшеницы, ржи и овса [8]. Это вызывает проблемы со здоровьем, включая хронические заболевания, приводящие к патологии печени, иммунологическим эффектам, расстройствам пищеварения, репродуктивным и метаболическим нарушениям.

Фумонизин В1, конгенер фумонизинов, продуцируемых грибами Fusarium verticillioides и F. proliferatum, является наиболее распространенным, а также наиболее токсикологически значимым фумонизином [14]. Воздействие фумонизина В1 приводит к развитию рака пищевода и печени, подавлению иммунной системы, дефектам нервной трубки, нефротоксичности и другим аномалиям [15]. Таким образом, воздействие фумонизина на человека и животных в последнее время вызывает серьезную озабоченность.

Неблагоприятное воздействие микотоксинов и их негативное влияние на рынок пищевых продуктов привело к разработке различных стратегий профилактики и обеззараживания [4, 9]. Одна категория подходов включает физические методы (например, сортировку, разделение, промывку или облучение) и химическую обработку (использование оснований и окислителей). Другая категория включает обеззараживание с использованием адсорбентов, которые потенциально могут быть включены в рацион животных. Такие материалы, обладающие адсорбционными свойствами, могут снижать биодоступность токсинов за счет их иммобилизации. К ним относятся микро- и наноразмерные минералы и неминеральные частицы, например, глинистые минералы, цеолиты, активированный уголь и их производные [1, 2, 11].

В последнее время технология биосорбции появилась как предпочтительная альтернатива обычным адсорбирующим материалам, с потенциальными преимуществами низкой стоимости, большей рентабельности, практичности и хорошей эффективности. В биосорбентах на матрицы (в нашем случае бентонит и цеолит) иммобилизируют микробные клетки почвенных сапрофитов B. mucilaginosus или P. mucilaginosus, которые продуцируют экзополисахариды, увеличивающие сорбционную емкость матрицы в 3 раза из-за присутствия в полисахаридах достаточного количества карбоксильных групп [10].

Целью настоящей работы являлась оценка потенциальных защитных эффектов биосорбентов на основе бентонита и цеолита по отношению к фумонизину В 1 in vitro в сравнении с коммерческими препаратами, используемыми в настоящее время в животноводстве.

Материал и методы исследований. Методика определения адсорбционной емкости описана ранее в работе Тарасовой Е.Ю. [12] и включает последовательную инкубацию при различных значениях pH (2; 8) и температуре в условиях in vitro. Первым смоделированным отделом желудочнокишечного тракта являлся желудок (pH – 2,0), далее кишечник (pH – 8,0). В эксперименте in vitro фумонизин В1 (Sigma – Aldrich) использовали в концентрации 0,001 % по отношению к адсорбенту. Эксперименты по адсорбции проводили в трех повторностях с использованием буферных растворов. Количество фумонизина В1, связанного адсорбентами, рассчитывали по разнице между начальной и конечной концентрациями фумонизина В1 в супернатанте. Для определения адсорбционной способности исследуемых сорбентов по отношению к фумонизину В1 моделировали условия желудочнокишечного тракта. На первой стадии 10 мкг фумонизина В1 в водно-спиртовом растворе и исследуемые сорбенты (10 мг) вводили в среду, имитирующую условия желудка (рН 2, 37±0,2 °C, 30 мин), затем центрифугировали и отбирали первый супернатант. Образовавшийся комплекс помещали в среду, имитирующую условия кишечника (рН 8,37±0,2 °C, 30 мин), затем центрифугировали и отбирали второй супернатант.

В супернатантах от каждой стадии имитации желудочно-кишечного тракта методом иммуноферментного анализа с помощью набора «RIDASCREEN® FUMONISIN» (R-Biopharm) количественно определяли фумонизин В 1 .

При получении потенциальных адсорбентов использовали штамм 574 бактерии P.mucilaginosus, который является эффективным продуцентом экзополисахаридов. Глубинное культивирование культуры осуществляли на жидкой питательной среде, содержащей мелассу и кукурузный экстракт, при непрерывном перемешивании в течение 3 суток. По окончании культивирования получили (2±0,5) г/л биомассы и (8,5±0,5) г/л экзополисахаридов, число выживаемых клеток не менее 108 КОЕ/мл. В качестве носителя использовали стерилизованные бентонит и цеолит, а также обожженные бентонит и цеолит (высушенные при температуре 1000 °С). Данные материалы смешивали с культуральной жидкостью (КЖ), соотношение «носитель:КЖ» в соответствии «4:3». После этого культуру выдерживали в термостате при температуре (30,0±1) °С в течение 5-6 ч. Далее потенциальные адсорбенты высушивали при температуре (60,0±1) °С в течение 24 ч. Таким образом, в опыте использованы следующие образцы биосорбентов: образец № 1 получен на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus и обожженного бентонита; образец № 2 получен на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P.mucilaginosus и цеолита; образец № 3 получен на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus и бентонита; образец № 4 получен на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus и обожженного цеолита.

В качестве препаратов сравнения использовали коммерческие кормовые добавки Ветохит (ООО ПТК «Питербио») – образец № 5 и Заслон (ООО «БИОТРОФ», Санкт-Петербург) – образец № 6. Ветохит включает композицию натуральных компонентов – органических кислот, пектина из морских трав Zosteraceae, природных минералов, лигнано-силибинового и хитин-хитозанового комплексов. Заслон представляет собой адсорбент-нейтрализатор микотоксинов, состоящий из синергетической смеси минералов органического происхождения, эфирных масел и штамма бактерий Bacillus subtilis.

Результат исследований.

Наивысшие значения адсорбции фумонизина В1 при рН 2 составили (97,1±0,9) % у биосорбента № 1, полученного на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P.mucilaginosus и обожженного бентонита. Сорбция фумонизина В1 другими испытываемыми образцами была ниже этого показателя на 8,6; 5,4; 6,3; 2,8; 7,7 % соответственно у 2; 3; 4; 5 и 6 адсорбентов (Рисунок 1).

Результаты исследования десорбции показали, что Заслон при смене рН с кислой на щелочную образовывал самый непрочный комплекс с фумонизином В 1 , потери которого составили 8,1 %. Образец № 4 был наиболее эффективным в прочном связывании с фумонизином В 1 . Значения десорбции представлены в таблице 1.

Показатели истинной сорбции представлены на рисунке 2.

Из рисунка 2 видно, что максимальная эффективность удаления фумонизина В 1 достигнута при использовании биосорбента на основе высушенного при 1000 °С бентонита и бактерии P.mucilaginosus, а также коммерческого адсорбента Ветохит. Эффективность удаления фумонизина В 1 составила соответственно 9,43 и 9,09 мкг.

м к г

Рисунок 1 – Адсорбция фумонизина В 1 in vitro (pH 2)

Таблица 1 – Характеристика десорбционной способности испытываемых адсорбентов

Образец	Десорбция, %
Обожженный бентонит + внеклеточные полисахариды, синтезируемые штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus	2,8±0,1
Цеолит + внеклеточные полисахариды, синтезируемые штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus	2,5±0,1
Бентонит + внеклеточные полисахариды, синтезируемые штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus	3,4±0,2
Обожженный цеолит + внеклеточные полисахариды, синтезируемые штаммом 574 бактерии P. mucilaginosus	1,8±0,1
Ветохит	5,2±0,4
Заслон	8,1±0,8

%   85

Рисунок 2 – Истинная адсорбция фумонизина В 1 in vitro (pH 8)

Заключение. Таким образом, у всех изучаемых образцов наивысшая адсорбция была обнаружена при pH 2. Из-за действия фумонизина В 1 , как «промотора» опухолевых очагов рака печени и последующего усиления печеночной канцерогенности афлатоксина B 1 , популяции, потребляющие продукты, загрязненные афлатоксином В 1 и фумонизином B 1 могут подвергаться повышенному риску развития гепатоцеллюлярной карциномы. Следовательно, интервенционная терапия для предотвращения заболеваний печени и рака, вызванных микотоксинами, должна быть приоритетной. Результаты этого исследования показывают значительный потенциал разработанных биосорбентов в качестве адсорбентов микотоксинов, однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы уточнить компоненты, которые участвуют в биосорбции микотоксинов, и подтвердить их эффективность in vivo. Установлено, что биосорбент, полученный на основе внеклеточных полисахаридов и обожженного бентонита эффективно снижает биодоступность фумонизина В1 in vitro, степень адсорбции составляет 94,3 %.

Резюме

Целью исследования являлась оценка эффективности четырех биосорбентов в сравнении с коммерческими адсорбентами Ветохит и Заслон в уменьшении токсических эффектов фумонизина В 1 . Проводили количественное определение фумонизина В 1 в супернатантах от имитации пищеварения в разных отделах желудочно-кишечного тракта методом иммуноферментного анализа с помощью набора «RIDASCREEN® FUMONISIN» (R-Biopharm). Результаты исследования in vitro (pH 2,0, 8,0) показали, что образец № 1, полученный на основе внеклеточных полисахаридов, синтезируемых штаммом 574 бактерии P.mucilaginosus и обожженного бентонита адсорбировал больше фумонизина В 1, чем другие биосорбенты и коммерческие препараты (9,43 мкг против 8,60, 8,83, 8,90, 9,09 и 8,13 мкг соответственно). Это позволяет предположить, что разработанные биосорбенты являются эффективными в снижении токсических эффектов фумонизина В 1 .