Изучение углеводородокисляющей активности родококков, иммобилизованных в макропористом криогеле поливинилового спирта

Иммобилизованные клетки микроорганизмов широко используются в биотехнологиях получения целевых веществ (Синицин и др., 1994). Процесс иммобилизации микробных клеток способствует существенному повышению их каталитической активности и устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды. Использование криогелей различной природы для закрепления бактериальных клеток (рис. 1) обеспечивает проведение данного процесса в «мягких» условиях, т. е. при физиологических значениях температуры, pH и без применения токсичных химических веществ. Криогель на основе поливинилового спирта – это макропористый, высокопрочный, по-

Рис. 1. Клетки Rhodococcus ruber ИЭГМ 231, иммобилизованные в макропористом криогеле поливинилового спирта, в сканирующем электронном микроскопе: 1 – х 4500; 2 – х 25000

лимерный материал, получаемый в результате замораживания с последующим оттаиванием концентрированных водных растворов данного полимера (Лозинский, Плиева, Зубов, 1995).

В настоящее время наиболее разрабатываемыми в биотехнологическом отношении актинобактериями являются представители рода Rhodococcus sensu stricto (Ившина, 1997). В частности показано (Толстиков, Гришко, Ившина, 2003), что родококки катализируют реакции стереоселективного окисления фенилметилового сульфида (тиоанизола) (1) и его гомологов в соответствующие (R)- или (S)-суль-фоксиды (2), широко применяемые в химической и

фармакологической промышленности. Цель настоящей работы – изучение углеводородокисляю-щей активности иммобилизованных клеток родо-

кокков.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы R. ruber ИЭГМ 231 и R. rhodochrous ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алкано-трофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, . Культуры параллельно выращивали в мясопептонном бульоне и минеральной среде в присутствии н-гексадекана (Каталог штаммов…, 1994). В качестве носителя иммобилизованных клеток использовали криогель поливинилового спирта марки 40/2 (ГОСТ 10779-78) производства предприятия «Азот» (Невинномысск). Формирование гранул криогеля с закрепленными в них клетками родококков проводили согласно ранее описанной методике (Kuyukina et al., 2006). Для гидрофобизации криогеля использовали Rho-dococcus биосурфактант (Kuyukina et al., 2001). Сравнительное определение жизнеспособности свободных и иммобилизованных клеток родокок-ков осуществляли с помощью специфического окрашивания иодонитротетразолием фиолетовым. Каталитическую активность свободных клеток родококков, а также включенных в матрицу полимерного криогеля определяли в экспериментах по биодеградации н-гексадекана и трансформации тиоанизола. Количество остаточного н-гексадекана определяли гравиметрически. Анализ продуктов биотрансформации тиоанизола осуществляли методами тонкослойной хроматографии, а также хромато-масс-спектрометрии с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N с квадрупольным масс-спектрометром Agilent MSD 5973N в качестве детектора и кварцевой колонкой HP-5 MS SN US 1518974`-1 (Agilent, США). Долговременное хранение гранул биокатализатора осуществляли в высушенном виде при комнатной или пониженной температурах и в физиологическом растворе при комнатной или пониженной температурах. Жизнеспособность иммобилизованных клеток в процессе хранения контролировали еженедельно в течение 10 месяцев.

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Для статистической обработки полученных данных использовали программу STA-TISTICA 6.0. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В результате исследований установлено, что для иммобилизации родококков, предварительно выращенных в мясопептонном бульоне, оптимальное объемное соотношение клеточной массы и раствора поливинилового спирта составляет 1 : 3 с добавлением 10% Rhodococcus- биосурфактанта (табл. 1). Для клеток, выращенных в присутствии н- гексадекана, такое соотношение составляет 1:2, при этом не требуется добавления Rhodococcus- биосурфактанта (табл. 2).

Таблица 1

Характеристика биокатализатора на основе иммобилизированных клеток родококков, выращенных на мясопептонном бульоне

Соотношение клеточная суспензия : криогель, v/v	Количество клеток родококков в 1 грануле криогеля, x 103	Концентрация Rhodococcus -биосурфактанта, %	Распределение гранул криогеля в двухфазной среде	Механическая прочность гранул криогеля
2:1	210 ± 1.0	3	Вода	Низкая
2:1	21.0 ± 1.0	5	Углеводород/вода	Низкая
2:1	21.0 ± 1.0	10	Углеводород/вода	Низкая
1:1	13.5 ± 1.5	3	Вода	Низкая
1:1	13.5 ± 1.5	5	Углеводород/вода	Низкая
1:1	13.5 ± 1.5	10	Углеводород/вода	Низкая
1:2	8.0 ± 0.6	3	Вода	Высокая
1:2	8.0 ± 0.6	5	Вода	Высокая
1:2	8.0 ± 0.6	10	Углеводород/вода	Низкая
1:3	6.5 ± 0.4	3	Вода	Высокая
1:3	6.5 ± 0.4	5	Вода	Высокая
1:3	6.5 ± 0.4	10	Углеводород/вода	Высокая
1:5	3.0 ± 0.2	3	Вода	Высокая
1:5	3.0 ± 0.2	5	Вода	Высокая
1:5	3.0 ± 0.2	10	Вода	Высокая

Подобранные условия иммобилизации обеспечивают высокую концентрацию жизнеспособных клеток, заключённых в гель, значительную механическую прочность биокатализатора и распределение гранул криогеля на границе раздела фаз «углеводород–вода». Межфазная локализация приводит к тесному взаимодействию гранул катали- затора со средой в гидрофильной и гидрофобной фазах, что способствует одновременному поступлению углеводородного субстрата, воды и кислорода к иммобилизованным клеткам.

По нашим данным, углеводородокисляющая активность закреплённых в криогеле клеток существенно выше по сравнению с таковой свободных клеток. Так, степень биодеградации н-гексадекана иммобилизованными клетками родококков достигает 51%, тогда как данный показатель для свободных клеток составляет лишь 21%. Сравнительный анализ данных по окислению тиоанизола свободными и закрепленными бактериальными клетками показал, что при использовании свободных клеток родококков полная конверсия сульфида достигается только через 3 сут после его добавле- ния, тогда как использование иммобилизованных клеток позволяет искючить двухдневную стадию подготовки биокатализатора и осуществить полную конверсию тиоанизола уже за 24 ч при условии одновременного введения биокатализатора и субстрата. При этом относительное содержание побочного продукта – сульфона тиоанизола (3) – не превышает 9.5% (рис. 2).

Таблица 2

Характеристика полученного биокатализатора на основе клеток родококков, выращенных в жидкой минеральной среде с добавлением н-гексадекана

Соотношение клеточная суспензия : криогель, v/v	Количество клеток родо-кокков в 1 грануле криогеля, x 103	Распределение гранул криогеля в двухфазной среде	Механическая прочность гранул криогеля
2 : 1	12.3 ± 2.0	Углеводород / вода	Низкая
1 : 1	9.3 ± 1.5	Углеводород / вода	Низкая
1 : 2	6.2 ± 0.4	Углеводород / вода	Высокая
1 : 3	4.6 ± 0.6	Вода	Высокая
1 : 5	3.1 ± 0.7	Вода	Высокая

100 %

100 ^%

eLLJi 01111

-20      ³

□ Тиоанизол

□ Сульфоксид

Время, сут

• □    Сульфон

• □    Сульфоксид □ Сульфон

Время, сут

А

Б

Рис. 2. Динамика накопления продуктов биотрансформации тиоанизола с использованием свободных (А) и иммобилизованных (Б) клеток R. rhodoсhrous ИЭГМ 66

Установлено, что оптимальным способом долгосрочного поддержания полученного биокатализатора является его хранение в высушенном виде при комнатной или пониженной температурах. При этом жизнеспособность иммобилизованных клеток родо-кокков сохраняется на уровне 60–80% в течение 10 месяцев.

Исследования поддержаны грантами Программы Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” и РФФИ № 04-04-97518-р_офи; 07-04-97612-р_офи.