Изучение условий эффективного введения трансгенов в эмбриональные клетки кур с использованием лентивирусной векторной системы

К настоящему времени перспективность использования ретровирусных и лентивирусных векторных систем для генетической модифика-

^∗ Работа выполнена при финансовой поддержке государства в лице ФАНО, номер госрегистрации НИР 01201455101. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ВИЖ им. Л.К. Эрнста.

ции сельскохозяйственной птицы показана в ряде работ (1-6). При этом одной из проблем при получении трансгенной птицы остается наличие большого числа эмбриональных клеток (порядка 60000-100000) на начальном этапе инкубации и необходимость применения высококонцентрированных вирусных препаратов (около 10⁹ вирусных частиц/мл) для достижения относительно приемлемой эффективности введения трансгенов. Использование конститутивных промоторов-энхансеров, таких как промотор-энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), промотор-энхансер гена β -актина птиц, позволяет добиваться значительной экспрессии (до нескольких миллиграммов белка на 1 мл в сыворотке крови и белке яйца) у мозаичных форм (G ₀ ), полученных из эмбрионов после введения трансгенов. Однако уже в следующих поколениях (G ₁ и G ₂ ) экспрессия значительно снижается (5). Причины этого пока не понятны. Возможно, высокая степень экспрессии чужеродного белка в различных органах и тканях действует как селективный фактор. Кроме того, было замечено, что уровень экспрессии прямо коррелирует с дозой гена (числом копий вируса в расчете на клеточный геном), то есть вероятность различных физиологических дефектов у наиболее перспективных продуцентов значительно возрастает (2, 7-9). Предпринимались также попытки добиться тканеспецифического выражения трансгенов с помощью регуляторных элементов, контролирующих синтез яичного овальбумина (10-14). Как указывают авторы, экспрессия трансгенов у нескольких поколений животных была относительно стабильной, тем не менее, достигнутые уровни синтеза белка оказались примерно в 20-50 раз ниже, чем при использовании конститутивных промоторов.

Векторные системы, полученные на основе интегративных вирусов, таких как ленти- и ретровирусы, представляют собой эффективный инструмент для введения и выражения генов вследствие ряда уникальных характеристик: представители этого семейства способны стабильно интегрировать в геном клетки-хозяина; относительно небольшие размеры генома позволяют легко манипулировать с ним in vitro; внутренние последовательности генома могут быть удалены таким образом, что все функции, необходимые для репликации, будут предоставлены in trans; используя поверхностные гликопротеины вируса, тропные к широкому спектру хозяев, можно инфицировать гибридными вирионами практически любой вид и тип клеток позвоночных.

В предпринятом нами исследовании особенностей введения и выражения генов в клетках сельскохозяйственной птицы первым этапом стала оптимизация стандартного протокола получения векторов на основе ленти-вирусной системы, что позволило значительно увеличить титр используемого вирусного препарата. Также наши данные по изучению условий инфицирования куриных эмбрионов лентивирусными препаратами дают основания предположить, что его результат можно прогнозировать.

Цель представляемой работы заключалась в оценке влияния количества и соотношения между компонентами лентивирусной векторной системы на физический и биологический титр продуцируемого вируса, а также времени введения полученного лентивирусного вектора в эмбрионы кур на результативность трансгенеза in vivo.

Методика. Объектом исследований служили эмбрионы кур кросса Птичное. В работе использовалась модифицированная лентивирусная векторная система второго поколения, в состав которой входили три различные плазмиды: psPAX2, содержащая гены gag-pol ; pLPG, кодирующая поверхностный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VVS-G);

pWPXL — самоинактивирующийся лентивирусный вектор, несущий ген eGFP (enhanced green fluorescence protein) под контролем промотора гена фактора элонгации 1 РНК-полимеразы II человека (hEFla) (15). Плазмида pWPXL была использована для конструирования вектора pWCAG. Вирусный вектор конструировали с помощью стандартных методов молекулярного клонирования (16).

Для получения рекомбинантного вируса, а также определения вирусных титров использовали линию клеток человека 293T. Клетки этой линии обладают способностью к быстрому делению, а также могут с высокой эффективностью трансфицироваться плазмидной ДНК. Клетки культивировали в среде DMEM (Dlbecco’s Modified Eagle’s Medium), содержащей эмбриональную телячью сыворотку (10 %), L-глутамин (2 мМ), пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл) в атмосфере 5 % СО ₂ при температуре 37 °С. Лентивирусный вектор вводили в клеточную линию 293T посредством кальций-фосфатной преципитации (16). При этом 1,7½10⁶ клеток помещали во флакон с площадью субстрата 25 см² за 1 сут до постановки эксперимента. На 2-е сут среду культивирования заменяли 1 мл свежей среды, содержащей ДНК всех трех плазмид векторной системы в различных соотношениях, и инкубировали в течение 6 ч в присутствии кальций-фосфатного буфера. Затем клетки подвергали химическому шоку, обрабатывая 20 % DMSO (диметилсульфоксид) в течение 5 мин, далее отмывали и помещали в свежую среду. На следующий день культуральную среду заменяли на свежую и продолжали инкубировать в течение 48 ч, после чего культуральный супернатант, содержащий вирус, собирали, очищали центрифугированием и аликвоты замораживали при -80 °С. Для концентрирования вирусных препаратов культуральные супернатанты подвергали ультрацентрифугированию (70000 g, 120 мин, +4 °С) и осадки ресуспендировали при +4 °С в небольшом объеме буфера TNE (Трис-HCl — 50 мM, pH 7,8; NaCl — 130 мМ; Na 2 -EDTA — 1 мМ).

Для определения физического титра вирусных векторов из аликвот (5-50 мкл) культуральных супернатантов, содержащих вирус, была выделена вирусная РНК с использованием набора фирмы «Qiagen» (США). Вирусная РНК служила матрицей для синтеза кДНК с обратным праймером, специфичным к последовательностям гена eGFP . Далее определяли количество вектора в real-time PCR (RT-PCR), используя синтезированную кДНК и праймеры, специфичные к гену eGFP . Стандартом для оценки числа копий гена служила серия 2-кратных разведений плазмидной ДНК вирусного вектора в нужном диапазоне. RT-PCR проводили на приборе MiniOpticon^TM («Bio-Rad», США). Биологический титр вируса определяли согласно описанию G. Tiscornia с соавт. (17). Супернатант, собранный при культивировании клонов клеток 293T, трансфицированных ретровирусными векторами, центрифугировали для удаления клеток и дебриса (10 мин, 3000 g). Инфицирование осуществляли немедленно после сбора вируса. Реципиентные клетки 293T высевали с плотностью 3½10⁵ на чашки Петри диаметром 60 мм за 1 сут до инфицирования. На 2-е сут среду заменяли на 1 мл свежей среды, содержащей полибрен (8 мкг/мл) и аликвоты тестируемого вируса. Инкубировали в течение 6 ч, после чего среду заменяли на свежую. Через 48-72 ч инкубации клетки снимали с субстрата трипсином, ресуспендировали в PBS и измеряли интенсивность флуоресценции еGFP на проточном цитофлуориметре FACSCanto («BD», США) с набором фильтров 480-490 нм (возбуждение) и 510 нм (эмиссия).

Хромосомную ДНК из эмбрионов кур выделяли солевым методом (16). Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически (прибор Hi-460

tachi U-1100, Япония) при X = 260 нм (ОЕ 260 = 1 соответствует 50 мкг двухнитевой ДНК). Чистоту препаратов ДНК оценивали, рассчитывая соотношение оптической плотностей при длине волны 260 и 280 нм. Нормализацию образцов ДНК проводили с использованием RT-PCR с праймерами и гибридизационной пробой, специфичными к ДНК, кодирующей 18S-рРНК у Gallus gallus . Число копий ДНК векторов определяли с праймерами и гибридизационными пробами, специфичными к eGFP . Для приготовления стандартов использовали плазмидную ДНК вирусного вектора, переведенную в линейную форму по уникальному сайту рестрикции и рас-титрованную в определенном ранее диапазоне. PCR-продукты получали в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 1½ буфер (Tрис-HCl — 10 мМ, pH 8,8, KCl — 50 мМ, Nonidet P400 — 0,08 %), MgCl 2 (2 мМ), dNTPs (0,2 мМ), праймеры (для каждого 0,25 мкМ), гибридизационную пробу (0,125 мкМ), Taq-полимеразу (1,25 U, «Fermentas», Литва) и 5 нг матрицы. Условия амплификации: 95 °С, 5 мин; 45 циклов — 94 °С, 30 с; 50 °С (варьирует), 30 с; 72 °С, 1 мин. Количественную RT-PCR и экспериментальный подбор оптимальных температур отжига олигонуклеотидов также проводили на приборе MiniOpticon^TM («Bio-Rad», США).

Анализ экспрессии eGFP в тканях эмбрионов выполняли на проточном цитофлуориметре (FACSCanto, «BD», США).

Результаты. Для определения условий эффективного введения трансгенов в эмбриональные клетки кур мы использовали лентивирусную векторную систему. В частности, была выбрана модифицированная система второго поколения, в состав которой, как уже отмечалось, входили три различные плазмиды: одна кодировала поверхностный гликопротеин G вируса везикулярного стоматита (VVS-G), вторая представляла собой классический «упаковщик» и содержала гены gag и pol , третья была самоинактиви-рующимся лентивирусным вектором (SN, self-inactivated) (15).

Для изучения эффективности введения конструкции и экспрессии генов в клетках птицы использовали ген eGFP в качестве структурного и гибридный энхансер-промотор CAG, содержащий энхансер ранних генов цитомегаловируса человека (hCMV, human cytomegalovirus) и промотор р-актина птицы (chiken β -actin promoter). Используя эти последовательности, на основе самоинактивирующегося лентивирусного вектора получили конструкцию с геном eGFP под контролем промотора CAG.

Структура лентивирусного экспрессирующего вектора pWCAG . Описание конструирования вирусного вектора приведено в тексте. LTR, LTR/sin (LTR, long terminal repeat; sin, selfinactivating), длинные концевые повторы лентивирусов: 5 ' -LTR — дикого типа, 3 ' -LTR/sin — самоинактивирующийся вариант. SD, SA (splice donor, splice acceptor) — донорный и акцепторный сайты сплайсинга; psi — область, ответственная за упаковку вирусной геномной РНК в вирион; RRE (rev responsible element) — сайт связывания Rev-белка, осуществляющего транспорт геномной молекулы РНК из ядра в цитоплазму; cPPT (central polypurine tract) — центральный полипуриновый тракт, принимающий участие в транспорте прединтегративного комплекса в ядро клетки; eGFP (enhanced green fluorescence protein) — ген зеленого флуоресцирующего белка; WPRE (woodchuck post-transcriptional regulatory element) — посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита древесного сурка. P CAG — гибридный регуляторный элемент, содержащий энхансер ранних генов цитомегаловируса человека и промотор гена р -астина птицы. Sall, PacI — сайты рестрикции, которые были использованы для клонирования регуляторных элементов.

Структура лентивирусного вектора показана на рисунке. Для получения вектора pWCAG фрагмент размером 687 п.н., содержащий гибридный энхансер-промотор CAG в составе плазмиды psPAX2 (13), был ам-плифицирован, очищен из геля и клонирован по SalI-PacI сайтам рестрикции в составе плазмиды pWPXL (15).

Соотношение между компонентами при трансфекции оптимизировали экспериментально.

Как уже отмечалось, при получении вирусного препарата плазмиды psPAX2, pLPG и pWCAG, образующие трехкомпонентную векторную систему, вводили в клетки человека (линия 293T) посредством CaPO ₄ -преципитации. Используя плазмиды в разной пропорции, а также изменяя их общее количество (при сохранении пропорции) и состав компонентов среды, подобрали условия, обеспечивающие выход вирусных частиц в высоком титре.

В таблице 1 приведены данные, иллюстрирующие влияние различного соотношения между компонентами векторной системы на физический и биологический титр вируса. Как видно, 2-кратное уменьшение либо увеличение количества всех трех плазмид по отношению к исходному варианту не оказывало значительного воздействия на титр вируса (изменения не более чем в 2 раза). В то же время увеличение количества упаковщика (pLPG) и вектора (pWCAG) по сравнению со стандартным вариантом (1:2:3, psPAX2: pLPG:pWCAG) приводило более чем к 10-кратному падению титра. Интересно отметить, что 2-кратное уменьшение количества упаковщика позволило повысить титр более чем в 4 раза по отношению к стандарту. Этот вариант был использован нами в дальнейших экспериментах для получения вирусных препаратов.

1. Титр вирусного препарата, применяемого для трансформации клеток птицы in vivo, в зависимости от количественного соотношения между компонентами векторной системы, которая использовалась для его получения

Титр вируса         I 1:2:331 (1:2:3)/2 □ 1:4:3     1:4:6 □ 2:2:3      1:1:3

Физический, число копий РНК/мл  5,6½109     2,9½109     6,9½108   5,1½108   5,2½109    1,9½1010

Биологический, КОЕ/мл            6,7½10⁶     3,4½10⁶     8,3½10⁵   5,8½10⁵   6,3½10⁶   2,4½10⁷

П р и м еч а ни е. Приведены количественные соотношения плазмид (соответственно psPAX2, pLPG и pWCAG).

В результате для вектора с CAG-промотором мы получили титры 2,4½107 КОЕ/мл. Биологический титр вируса был определен на клетках 293T по флуоресценции eGFP. Количество вируса в препарате оценивали по содержанию специфической РНК в RT-PCR («Bio-Rad», США). После концентрирования препарата ультрацентрифугированием титр для вектора составил 6,2½108 КОЕ/мл.

Полученный вирусный препарат использовали для введения в эмбриональные клетки в разные сроки: в I группе куриные эмбрионы инфицировали на 20-24-й ч инкубации, во II — на 50-55-й ч (табл. 2). На 7-е сут инкубации яйца вскрыли, и у развившихся эмбрионов были взяты фрагменты ткани в качестве образцов для выделения хромосомной ДНК и анализа экспрессии eGFP. Образцы ДНК со значением OE ₂6₀/₂₈₀ не менее 2 служили эталонными для нормализации остальных образцов. Все расчеты производили, исходя из того, что молекулярная масса диплоидного генома Gallus gallus составляет 2,5 пг.

По данным RT-PCR, в I группе средняя эффективность введения лентивирусного вектора в эмбриональные клетки кур составила 0,78 копии на диплоидный клеточный геном, то есть 78,0 % эмбриональных 462

клеток содержали интегрированную копию ДНК вектора. Во II группе показатель был в 2,5 раза ниже — 31,0 %. При этом в I группе эмбрионов на клеточный геном приходилось от 0,10 до 5,52 копии, причем у четырех из 10 образцов этот показатель составлял не менее одной копии провируса в расчете на диплоидный геном, тогда как для II группы диапазон значений был намного меньше — от 0,00 до 0,70 копии ДНК провируса. Изучение экспрессии маркерного гена eGFP в тканях эмбрионов при помощи проточного цитофлуориметра выявило ее в среднем в 34,3 % клеток эмбрионов в I группе и в 30,0 % эмбриональных клеток во II группе. Таким образом, во II группе показатели эффективности введения векторов, полученные с использованием RT-PCR и проточной цитофлуорометрии, практически совпадали (соответственно 31,0 и 30,0 %), тогда как в I группе они различались в 2,3 раза (соответственно 78,0 и 34,3 %; см. табл. 2).

2. Оценка эффективности введения лентивирусного вектора pWCAG in vivo в эмбриональные клетки кур кросса Птичное в зависимости от возраста эмбрионов

Группа (время после начала инкубации, ч)	Номер образца	Число копий вектора в расчете на диплоидный клеточный геном	Доля клеток эмбриона, экспрессирующих eGFP, %
I группа (20-24)	1-1	0,96
	1-2	1,86
	1-3	0,33
	1-4	0,10
	1-5	0,36
	1-6	0,14
	1-7	5,52*
	1-8	0,68
	1-9	0,44
	1-10	2,20
средняя эффективность		0,78 (78 %)
	1-11		44,8
	1-12		33,1
	1-13		28,4
	1-14		32,8
	1-15		32,5
средняя эффективность			34,3
II группа (50-55)	2-4	0,30
	2-5	0,30
	2-6	0,38
	2-7	0,00
	2-8	0,70
	2-9	0,34
	2-10	0,15
средняя эффективность		0,31 (31 %)
	2-11		15,9
	2-12		42,7
	2-13		13,7
	2-14		37,8
	2-15		39,7
средняя эффективность			30,0
П р и м еч а ни е. При определении средней эффективности образец, помеченный звездочкой (*), не
учитывали.

Исходя из полученных результатов, средняя эффективность переноса генов с помощью лентивирусных векторов составила 30,0-34,3 % и слабо варьировала при изменении времени введения после начала инкубации эмбрионов, то есть, вероятно, только часть клеток эмбриона доступна для инфицирования вирусом. Поскольку в оба срока инкубации использовались вирусные препараты с одинаковыми титрами, отмеченная разница в числе копий вектора в составе клеточного генома в I и II группах эмбрионов, по-видимому, объясняется тем, что на более ранних стадиях в клетки эмбриона проникало больше вирусных частиц (см. табл. 2). Это 463

позволяет предположить, что куриные эмбрионы можно инфицировать лентивирусными препаратами с прогнозируемой эффективностью, варьируя титр вирусного препарата и время введения после начала инкубации эмбриона, тем самым добиваясь получения трансгенной птицы с ожидаемой «дозой» (числом копий) гена в зависимости от экспериментальных целей. Таким образом, эффективность переноса генов в эмбрионы кур с использованием лентивирусных векторов не зависит от стадии развития эмбриона, по крайней мере, в течение первых 55 ч инкубации и может быть прогнозируемой.

Итак, изучение условий введения лентивирусного вектора в эмбриональные клетки птицы показало, что биологические титры вирусных препаратов порядка 108 КОЕ/мл вполне достаточны для инфицирования до 78 % клеток на ранних этапах развития эмбриона. Изменяя соотношение между компонентами векторной системы по сравнению со стандартной схемой, удается значительно увеличить титр получаемого вирусного препарата. В дальнейших экспериментах подобранные условия предполагается использовать как инструмент для изучения факторов, оказывающих влияние на уровень и стабильность экспрессии трансгенов в клетках птицы в условиях in vivo.