Изучение устойчивости актинобактерий к солям ванадия

• ^а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

• ^ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Изучена устойчивость 64 чистых культур актинобактерий, хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики мик-рооганизмов (ИЭГМ), к солям ванадия в зависимости от pH среды культивирования бактериальных клеток. Определены минимальные ингибирующие концентрации для данных штаммов актинобактерий. Выявлено отсутствие корреляции между видовой принадлежностью исследуемых штаммов актинобактерий и их устойчивостью к солям ванадия. Установлено, что устойчи-■ вость актинобактерий к воздействию исследуемых солей ванадия увеличивается в 2-4 раза в условиях нейтральной реакции среды по сравнению с таковой при кислой и щелочной среде. Отобраны коллекционные штаммы актинобактерий, устойчивые к высоким концентрациям солей . ванадия.

Среди химических веществ, загрязняющих окружающую среду, особое место занимают тяжелые металлы. Это обусловлено тем, что металлы, в отличие от органических загрязнителей, не подвергаются процессам разложения и способны лишь к перераспределению между отдельными компонентами среды. К тяжелым металлам относят группу химических элементов, имеющих плотность более 5 г/см3 и относительную атомную массу более 40 а.е.м. (Фрумин, 2002). Ванадий - тяжелый металл, входящий в побочную подгруппу пятой группы периодической системы. Он образует преимущественно пятивалентные соединения, но характеризуется переменной валентностью от (II) до (V). В природе ванадий находится преимущественно в рассеянном состоянии и обнаруживается в железных рудах, нефти, асфальтах, битумах, горючих сланцах. Одним из главных источников загрязнения окружающей среды ванадием является нефть и продукты ее переработки (Barceloux, 1999). Данный металл активно аккумулируется клетками микроорганизмов, органами и тканями человека, теплокровных животных и гидробионтов. Ванадий содержится в альтернативных нитрогеназах некоторых почвенных бактерий, однако не является необходимым элементом для развития большинства прокариотных организмов (Ван Ни и др., 1990). Как микроэлемент ванадий участвует в регуляции углеводного обмена и сердечно-сосудистой деятельности высших позвоночных животных (Barceloux, 1999). Избыточное накопление ванадия оказывает токсическое воздействие на живые организмы. Токсический эффект ванадия обусловлен, главным образом, стимуляцией образования свободнорадикальных состояний ки слорода и изменением pH среды (Барский и др., 1999). Ванадий является ингибитором клеточных ферментов, в частности На+/К+-АТФ-азы (Willsky et al., 1985). Катионы ванадия легко образуют комплексы с гидроксильными, карбоксильными, фосфатными группами и ковалентные связи с сульфгидрильными группами. Они способны соединяться с белками, нуклеотидами, коферментами, фосфолипидами, практически со всеми типами веществ, участвующими в метаболизме клеток (Сенцова, 1985). Некоторые сахара и аминокислоты, водород, лактат, глицерол и диоксид углерода являются донорами электронов для пятивалентного ванадия (Lovley, 1993). Следует отметить, что токсический эффект тяжелых металлов в отношении микроорганизмов во многом зависит от pH среды. Так, токсичность ионов Cd2+ в бактериальных клетках увеличивается при значениях pH, характерных для щелочной среды (Иванов и др., 1997).

В настоящее время одним из перспективных с точки зрения эффективности, безопасности и экономичности методов очистки окружающей среды от загрязнений считается микробиологический. Клетки микроорганизмов способны концентрировать значительные количества металлов из среды независимо от того, имеют ли эти металлы физиологическое значение или их участие в метаболических процессах не установлено (Пименов и др., 1996; Gadd, Rehm, 1988). При эффективных биотехнологических методах очистки экосистем, загрязненных тяжелыми металлами и нефтепродуктами, предполагается использование микроорганизмов с высокой активностью оксигеназ и устойчивые к воздействию токсичных металлов (Christof!, Ivshina, 2002).

Цель настоящей работы - изучение устойчиво- Окончание табл. 1 сти коллекционных культур актинобактерий к солям ванадия в зависимости от pH среды культивирования бактериальных клеток. Вид, номер штамма Источники и география проб ИЭГМ 708 Шламохранилище, г. Полазна, Пермская обл., Россия Rhodococcus fascians Материалы и методы исследования ИЭГМ 34 Кожа карпа, Днепровское водохра- нилище, Украина В качестве объекта исследования служили 64 ЙЭГМ 38, Пластовая вода, нефтяное месторож- штамма актинобактерий, хранящихся в Региональной профилированной коллекции алканотрофных ИЭГМ 39 дение, Пермская обл., Россия ИЭГМ 170 Снег, район нефтепромысла, Пермская обл., Россия микроорганизмов ИЭГМ (Каталог штаммов..., ИЭГМ 278 Речная вода, Тюменская обл., Россия 1994; и принадлежа-щих к 2 видам рода Gordonia (G. rubropertincta, G. Rhodococcus ‘Чощ *us" ИЭГМ 27, ИЭГМ 28, Почва, загрязненная нефтью, Полтавская обл., Украина terrae), виду Dietzia marls и 6 видам рода Rhodococ- ИЭГМ 29 cus (R. erythropolis, R.fascians, R. “longus”, R. opacus, R rhodochrous и R. ruber) (табл. 1). Данные культуры актинобактерий выделены из различных ИЭГМ 31 Почва, загрязненная нефтью, Полтавская обл., Украина ИЭГМ 32 Почва, поле, Полтавская обл., Украина природных источников резко контрастных экологогеографических регионов, они характеризуются высокой активностью оксигеназного ферментного комплекса и проявляют высокую (от 20 до 85%) ИЭГМ 33 Почва, загрязненная нефтью, Ивано-Франковская обл., Украина ИЭГМ 68, ИЭГМ 69 Почва, район нефтепромысла, Пермская обл., Россия Rhodococcus opacus эмульгирующую активность (Ившина, 1997). ИЭГМ 56 Почва, Украина Таблица 1 Источники выделения коллекционных штаммов актинобактерий ИЭГМ 57 Почва, загрязненная нефтью, Украина ИЭГМ 59 Почва, Украина ИЭГМ 61 Почва, загрязненная нефтью, Украи- Вид, номер штамма Источники и география проб на ИЭГМ 246 Почва, полиэфирные волокна лавса- Dietzia mans на, Беларусь ИЭГМ 45 Пластовая вода, нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия ИЭГМ716Т Район утечки газового трубопровода, Великобритания Почва, загрязненная нефтью, Черниговская обл., Украина ИЭГМ 717 Почва, Великобритания ИЭГМ 55т Rhodococcus rhodochrous Вода, загрязненная нефтью, Камское водохранилище, Пермская обл., Россия ИЭГМ 62' Почва ИЭГМ 166 ИЭГМ 63, ИЭГМ 64, ИЭГМ 65 Почва, Украина ИЭГМ 291 Донные отложения, Тюменская обл., Россия ИЭГМ 646 Вода, г. Березники, Пермская обл., ИЭГМ 317 Кишечный тракт карпа Россия Gordonia rubropertincta ИЭГМ 647 Нефтепромысловая вода, Межевское нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия ИЭГМ 95 ‘ Почва ИЭГМ 96 Почва, пропитанная нефтью, Украина Rhodococcus ruber ИЭГМ 105 Вода, р. Днепр, Днепропетровская обл., Украина ИЭГМ 73 Грунтовая вода нефтяного месторождения, Пермская обл., Россия ИЭГМ 106 Воздушное заражение культуральной среды ИЭГМ 77 Вода, родник, контурная зона нефтяного месторождения. Пермская обл., Россия Почва, загрязненная нефтью, нефтяное месторождение, Ивано- ИЭГМ 128 ИЭГМ 84 Песчаная порода, Гомельская обл., Франковская обл., Украина Беларусь Gordonia terrae ИЭГМ 93 Песчаная порода, Восточная Сибирь, Ичерская площадь, Иркутская обл., Россия ИЭГМ 143* Почва ИЭГМ 144, ИЭГМ 146 Почва, пропитанная нефтью, Украина ИЭГМ 172 Пластовая вода, нефтяное месторождение, Пермская обл., Россия ИЭГМ 147, ИЭГМ 151 Вода, р. Днепр, Днепропетровская обл., Украина ИЭГМ 223, и^ГМ ТОЛ Почва, р-н Полазненского нефтепромысла, Пермская обл., Россия ИЭГМ 157 Вода, р. Днепр, Полтавская обл., Ук- ИЭГМ 225, раина - ИЭГМ 226 Rhodococcus erythropolis Вода, родник, р-н Ольховского нефтепромысла, Пермская обл., Россия ИЭГМ 185, ИЭГМ 186 Вода, Камское водохранилище, Пермская обл., Россия ИЭГМ 231 Снежный покров, р-н Полазненского нефтепромысла, Пермская обл., Россия ИЭГМ 201 Вода, родник, Пермская обл., Россия - ИЭГМ 235 ИЭГМ 256 Почва, загрязненная нефтью, У край- на Дерново-подзолистая почва, нефтегазовое месторождение, Пермская ИЭГМ 266, Почва, загрязненная нефтью, район ИЭГМ 327 ИЭГМ 267, нефтепромысла, Пермская обл., Рос- обл., Россия ИЭГМ 268, ИЭГМ 269, СИЯ Примечание.1 - типовой штамм, R. "longus” - нева- ИЭГМ 270 лидный вид.

В экспериментах применяли водные растворы (от 1,6 до 250,0 мМ) солей ванадия VOSO4 (рН=2,2), NaVO3 (рН=7,5) и Na3VO4 (pH-12,0). В качестве количественной характеристики резистентности исследуемых бактерий к солям ванадия приняли показатель минимальной ингибирующей концентрации (МИК), который определяли с помощью модифицированного нами микролуночного метода с использованием мясопептонного бульона. В качестве кон-тролей применяли бактериальную культуру, выращенную в питательной среде без металла, а также неинокулированную питательную среду. Планшеты инкубировали в течение трех суток при температуре 28°С. Учет результатов проводили с использованием красителя йодонитротетразолия фиолетового. Данный краситель действует в качестве конкурентного кислороду акцептора электронов в электрон-транспортной цепи аэробных микроорганизмов. При внесении красителя в среду происходит его восстанавление до нерастворимого в воде формаза-на. Формазан проявляется через несколько минут в виде красно-фиолетового окрашивания только в присутствии активно респирирующих микроорганизмов. Все эксперименты проводились в четырехкратной повторности.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета компьютерной программы Statistica (версия 6.0 для Windows).

Результаты и их обсуждение

В табл. 2 приведены результаты определения МИК солей ванадия в зависимости от pH среды культивирования исследуемых актинобактерий. Необходимо отметить, что 52 из 64 исследованных штаммов сохраняют жизнеспособность при концентрации ванадата натрия (рН=7,5) свыше 250,0 мМ (МИК для этих бактериальных культур находится выше предела растворимости данной соли). Данная величина превышает предельно допустимую концентрацию (ПДК = 150 мг/кг) ванадия в почве в 85 раз. По нашим данным, представителей актинобактерий разных родов по степени устойчивости к солям ванадия можно расположить в ряд: Gordonia>Rhodococcus>Dietzia при рН=2,2; Dietzia>Rhodococcus>Gordonia при рН=7,5 и 12,0 (табл. 2).

В экспериментах по изучению влияния кислотности среды культивирования на устойчивость бактериальных штаммов к ванадию использовали водные растворы солей металла с нейтральным значением pH.

Раствор VOSO4 (рН=7,7) готовили с использованием буфера, содержащего лимонную кислоту, а раствор Na3VO4 (рН=6,8) - с использованием трис(гидроксиметил)аминометан-малеатного буфера. Как видно из табл. 3, при применении забуфе-ренных растворов солей ванадия показатели МИК увеличиваются в 2-4 раза по сравнению с таковыми, полученными при использовании растворов данных солей, имеющих значения pH, свойственные кислым и щелочным средам.

Таблица 2

Резистентность актинобактерий к солям ванадия

Таблица 3

Резистентность актинобактерий к солям ванадия при нейтральных значениях pH

Следует отметить, что строгой корреляции между видовой принадлежностью штаммов актинобактерий и их устойчивостью к исследуемым солям ванадия в зависимости от pH среды нами не выявлено. Оказалось, что коллекционные культуры обладают индивидуальной устойчивостью к металлу, которую можно, по-видимому, объяснить приуроченностью исследуемых культур к различным экологическим нишам (см. табл. 1).

В результате проведенных исследований нами отобраны наиболее устойчивые к солям ванадия штаммы D. maris ИЭГМ 45, G. rubropertincta ИЭГМ 95, G. terrae ИЭГМ 147, R ruber ИЭГМ 93, ИЭГМ 231, для которых характерны следующие значения МИК: VOSO₄ - 25,0; NaVO₃ - более 250,0; Na₃VO₄ -100,0 мМ. '

Выводы

• 1.    Выявлено отсутствие корреляции между видовой принадлежностью исследуемых штаммов актинобактерий и их устойчивостью к солям ванадия.

• 2.    Обнаружено, что значения МИК ванадата натрия в отношении исследуемых коллекционных культур актинобактерий находятся выше предела растворимости данной соли.

• 3.    Установлено, что устойчивость актинобактерий к действию исследуемых солей ванадия увеличивается в 2-4 раза в условиях нейтральной реакции питательной среды по сравнению с таковой при кислых и щелочных средах. .