Изучение устойчивости к антибиотикам бактерий рода Bacillus методом серийных разведений

Введение . Основным этиологическим фактором в возникновении желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных является группа энтеропатогенных бактерий. К этой группе относятся такие микроорганизмы, как кишечная палочка, сальмонелла, синегнойная палочка, клебсиелла, шигелла, протей и другие. С целью подавления их роста применяют антибиотики, но при этом от антибиотиков в желудочно-кишечном тракте гибнут не только патогенные, но и полезные микроорганизмы, которые заселяют желудочно-кишечный тракт в норме и участвуют в процессах пищеварения. Поэтому нередко после применения антибиотиков у животных наблюдается дисбактериоз – расстройство пищеварения, связанное с гибелью в желудочно-кишечном тракте полезных микроорганизмов.

Для преодоления этой проблемы для лечения животных в последние годы одновременно с антибиотиками внутрь стали применять препараты, содержащие в своем составе полезные микроорганизмы. Эти микроорганизмы заселяют желудочно-кишечный тракт и тем самым восстанавливают его нормальную микрофлору и пищеварение. Такие микроорганизмы получили название «пробиотики» (pro – для, bios – жизнь). Кроме участия в пищеварительных процессах, пробиотики являются антагонистами по отношению к энтеропатогенным бактериям, чем обусловлен их лечебно-профилактический эффект. Совместное применение антибиотиков с пробиотиками позволяет наряду с уничтожением патогенных микроорганизмов сохранить микробиоценоз в кишечнике, не нарушая его функционирования. Поэтому одним из критериев отбора штаммов микроорганизмов с целью использования их в пробиотических препаратах является определение их устойчивости к антибиотикам.

Применяемые в настоящее время в ветеринарии пробиотические препараты содержат в своем составе живые микроорганизмы из семейства Lactobacillus или Bifidobacterium [1], но в последние годы в пробиотические препараты стали вводить спорообразующие микроорганизмы из рода Bacillus, такие как Bac. subtilis, Bac. cereus, Bac. licheniformis [2].

Особенностью пищеварения у жвачных животных является то, что поедаемый растительный корм накапливается в рубце, а вместе с кормом в рубец в большом количестве попадают микроорганизмы, которые становятся его постоянными обитателями. Стенка рубца не выделяет пищеварительных ферментов, ферменты продуцируют микроорганизмы рубца. Для жвачных животных особенно актуальны спорообразующие микроорганизмы из рода Bacillus . Споры в рубце прорастают и при этом они выделяют амилолитические и целлюлозолитические ферменты, которые расщепляют крахмал и целлюлозу растений до глюкозы.

Основное предназначение пробиотических микроорганизмов – это восстановление нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта после перенесенного заболевания. В опытах на сельскохозяйственных животных и птице было установлено, что скармливание пробиотиков увеличивает у них молочную продуктивность и приросты живой массы [3–6]. В связи с этим для животноводства актуальным является вопрос о способах применения пробиотиков – либо совместно с кормовыми антибиотиками, либо в составе кормовых добавок как с лечебно-профилактической целью, так и с целью увеличения у них продуктивности.

На сегодняшний день активность антибиотиков в отношении бацилл, применяемых в пробиотических препаратах, изучена недостаточно, между тем как оценка чувствительности бацилл к антибиотикам позволяет получить необходимую информацию для обоснования рационального применения антибиотиков совместно с пробиотиками при сохранении жизнеспособности последних. Об эффективности совместного применения антибиотиков с пробиотиками сообщают авторы [7].

Цель исследований : изучение устойчивости к антибиотикам бактерий рода Bacillus методом серийных разведений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) изучить устойчивость к антибиотикам микроорганизмов рода Bacillus; 2) определить минимальные подавляющие концентрации антибиотиков (МПК) к различным видам микроорганизмов рода Bacillus; 3) установить оптимальные сочетания антибиотиков с пробиотиками (in vitro) для их совместного эффективного использования.

Материал и методы исследований . Объектом исследований являлись споры микроорганизмов Bacillus subtilis , Bacillus cereus и Bacillus licheniformis . Микроорганизмы выделены и идентифицированы из предоставленного нами материала в ГосНИИ генетика (г. Москва). Микроорганизмы используются нами для производства кормовой патоки посредством гидролиза крахмала. Одновременно эти микроорганизмы, входящие в состав патоки, проявляют свойства пробиотиков [8].

Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных разведений. За основу были взяты методические указания [9]. Чувствительность микроорганизмов определяли к следующим антибиотикам – левомицетину, тетрациклину и гентамицину.

Активность антибиотика устанавливали по величине его минимальной подавляющей концентрации, вызвавшей полную ингибицию прорастания спор.

Метод серийных разведений осуществляли в пробирках объемом по 10 мл. В качестве питательной среды использовали стерильный отвар пшеничных отрубей. Готовили основной раствор антибиотика в концентрации 160,0 мкг/мл, из него готовили рабочие растворы с 2-кратным уменьшением концентрации антибиотика в каждом последующем разведении. В каждую пробирку вносили споры определенного микроорганизма в количестве 100 тыс. спор/мл. Для каждого микроорганизма готовили по 5 серий разведений одного из антибиотиков.

Заключение об устойчивости микроорганизмов к антибиотикам делали на основании подсчета разницы между количеством спор испытуемого микроорганизма, внесенных в начале эксперимента, и количеством проросших спор по окончании культивирования в присутствии заданной концентрации антибиотика. Подсчет микроорганизмов проводили согласно методике, описанной в [10], с использованием микроскопа МИКМЕД-5 и камеры Горяева. Параллельно ставили контрольную пробу со спорами, но без антибиотика. Пробирки инкубировали в термостате при t = 39 °С в течение одних суток.

Для получения статистически достоверных результатов все исследования проводили с 3-кратной повторяемостью.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента в программном пакете MS Excel 2010. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследований . В контрольных пробирках без антибиотика наблюдали 100 %-е прорастание спор каждого изучаемого вида микроорганизма.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что прорастание спор всех исследуемых видов бацилл начиналось при содержании левомицетина в пробирке в концентрации, равной 10 мкг/мл.

Таблица 1

Содержание левомицетина в пробирке, мкг/мл	Количество проросших спор/мл
	Bac. subtilis	Bac. cereus	Bac. licheniformis
80	-	-	-
40	-	-	-
20	-	-	-
10	50000±12,3	40000±9,1	25000±7,2
5	85000±16,7	70000±14,5	55000±11,8

Количество проросших спор бацилл в среде с левомицетином

На графике, представленном на рисунке 1, видно, что с увеличением в пробирке концентрации левомицетина количество проросших спор в среде уменьшалось, при содержании левомицетина в концентрации 20 мкг/мл споры не прорастали.

§■ 70

§ 60

X к a 50 о

40 о

С 30

? 20 о W 10

«

5            10           15           20

Кол-во левомицитина, мкг/мл

••"••■• Bac.subtilis

Рис. 1. Динамика прорастания спор бацилл при левомицетине

Из данных, представленных в таблице 2, рациклина в пробирке в концентрации, равной видно, что прорастание спор всех исследуемых 20 мкг/мл.

видов бацилл начиналось при содержании тет-

Количество проросших спор в среде с тетрациклином

Таблица 2

Содержание тетрациклина в пробирке, мкг/мл	Количество проросших спор/мл
	Bac. subtilis	Bac. cereus	Bac. licheniformis
80	-	-	-
40	-	-	-
20	25000±11,5	15000±12,4	5000±8,7
10	60000±14,8	45000±13,8	25000±14,1
5	90000±15,7	80000±16,7	65000±15,9

На графике, представленном на рисунке 2, видно, что с увеличением в пробирке концентрации тетрациклина количество проросших спор в среде уменьшалось, при содержании тетрациклина в концентрации 40 мкг/мл споры не прорастали.

0х 80

§70

s 60

g 50

м 30

£20

•—•••• Bac.subtilis

Рис. 2. Динамика прорастания спор бацилл при тетрациклине

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что прорастание спор всех исследуемых видов бацилл начиналось при содержании гентамицина в пробирке в концентрации, равной 40 мкг/мл.

На графике рисунка 3 видно, что с увеличением в пробирке концентрации гентамицина количество проросших спор в среде уменьшалось, при содержании левомицетина в концентрации 80 мкг/мл споры не прорастали.

Количество проросших спор бацилл в среде с гентамицином

Таблица 3

Содержание гентамицина в пробирке, мкг/мл	Количество проросших спор/мл
	Bac. subtilis	Bac. cereus	Bac. licheniformis
80	-	-	-
40	40000±16,8	30000±14,7	10000±8,6
20	65000±18,4	50000±17,6	25000±12,4
10	85000±21,4	70000±19,4	50000±16,8
5	100000±22,5	90000±21,6	70000±20,5

X s a

И I

■■•■••■■ Bac.subtilis

Рис. 3. Динамика прорастания спор бацилл при гентамицине

Выводы . На основании результатов проведенных исследований по изучению устойчивости к антибиотикам пробиотических микроорганизмов можно заключить следующее: по устойчивости к антибиотикам микроорганизмы располагались в следующем убывающем порядке – Bac. subtilis , Bac. cereus , Bac. licheniformis .

Минимальная подавляющая концентрация левомицетина для всех исследованных видов микроорганизмов составила 20 мкг/мл, у тетрациклина – 40 мкг/мл, а у гентамицина – 80 мкг/мл. При этом наиболее устойчивым к изучаемым антибиотикам оказался микроорганизм Bacillus subtilis , его споры прорастали лучше, чем споры других видов бацилл при наличии в среде одного и того же антибиотика в одинаковых концентрациях. Хуже всего в присутствии антибиотиков прорастали споры микроорганизма Bacillus licheniformis .

Наибольшая устойчивость у всех испытуемых микроорганизмов оказалась к гентамицину, а наименьшая – к левомицетину.

Данные по устойчивости пробиотиков к антибиотикам необходимо учитывать при отборе штаммов микроорганизмов для применения их совместно с антибиотиками.

Для повышения эффективности пробиотического препарата, содержащего в своем составе споры микроорганизма Bacillus subtilis , его целесообразно применять совместно с гентамицином, так как при таком сочетании прорастает наибольшее количество спор этого пробиотического микроорганизма.

Наименьшая устойчивость ко всем антибиотикам была установлена у Bac. licheniformis , поэтому применять данный микроорганизм в качестве пробиотика следует после завершения ан-тибиотикотерапии.