Изучение вирус-индуцированного апоптоза опухолевых клеток in vitro

В работе показана способность вакцинных штаммов вирусов осповакцины, паротита и венесуэльского энцефаломиелита индуцировать апоптоз опухолевых клеток в системе in vitro. Установлено, что вакцинный штамм вируса паротита проявляет апоптоз-индуцирующие свойства в отношении клеток эритромиелолейкоза человека К-562 в ранние сроки инкубации, а вирус ВЭЛ – в более поздние. Апоптоз-индуцирующие свойства вируса осповакцины наиболее ярко проявляются в отношении клеток аденокарциномы Эрлиха. Отсутствие индукции апоптоза клеток карциномы Эрлиха вирусом ВЭЛ может объясняться как типом и индивидуальной чувствительностью клеток к применяемым индукторам апоптоза, так и природой и индивидуальными свойствами этих агентов.

STUDY OF VIRUS-INDUCED APOPTOSIS OF TUMOR CELLS IN VITRO

I.G. Vidyaeva, L.N. Urazova, T.I. Kuznetsova

Oncology Research Institute, Tomsk Scientific Center of SB RAMS

This review shows the ability of vaccine strains of pox vaccine, parotitis and Venezuelan encephalomyelitis viruses to induce tumor cell apoptosis in vitro. Vacine stain of parotitis virus has been found to demonstrate apoptosis-induced characteristics with respect to human erythromyeloleukosis K-562 in early, whereas Venezuelan encephalomyelitis virus (VEV) in late terms of incubation. Apoptosis-induced characteristics of pox vaccine virus are manifested most clearly in Erlich’s adenocarcinoma cells. Inability of VEV to induce apoptosis of Erlich’s carcinoma cells can be explained both by the type and individual sensitivity of cells to apoptosis inductors and by the nature and individual properties of these agents.

В настоящее время в онкологическую практику прочно входит биотерапия – новый метод, имеющий на вооружении целый арсенал различных модификаторов биологических реакций, таких как факторы роста, антитела, цитокины, вирусные агенты [12, 16]. При этом онколитическим вирусам уделяется большое внимание, так как их противоопухолевое действие реализуется путем нескольких потенциальных механизмов, в первую очередь за счет прямого литического действия, возникающего в результате репликации вирусов в малигнизированных клетках [17]. Другой механизм – посреднический, при котором онколитические вирусы воздействуют на опухолевые клетки, индуцируя специфический и неспецифический противоопухолевый иммунитет [19].

В проведенных нами ранее исследованиях было показано, что вакцинные штаммы вирусов (паротита, венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ) и осповакцины) вызывают торможение роста первичных опухолей, обладают высоким антиметастатическим потенциалом [3, 8]. Было установлено, что вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ, оспы, паротита вызывают различные ци- тодеструктивные нарушения в клетках экспериментальных опухолей. Кроме того, изученные препараты оказывают стимулирующее действие на некоторые параметры Т-клеточного звена иммунитета. Наблюдается повышение цитостатической и мембранотоксической активности клеток тимуса и селезенки в отношении клеток перевиваемых опухолей [2].

Недавно в литературе появились сообщения о способности вирусов индуцировать в опухолевых клетках апоптоз, в частности на примере онколитического аденовируса [18]. Нарушения процесса апоптоза лежат в основе развития многих патологических процессов, в том числе опухолевого [1, 9, 13]. В клетках опухолей человека апоптоз может быть спонтанным или индуцированным. Индуцированный апоптоз является важнейшим механизмом действия различных схем противораковой терапии, показателем его эффективности [4, 9, 11, 14]. Руководствуясь вышеизложенным, мы сочли целесообразным исследовать вакцинные штаммы вирусов паротита, ВЭЛ и осповакцины в качестве апоптоз-индуцирующих агентов.

Таблица 1

Влияние вакцинных штаммов вирусов на апоптотическую гибель клеток эритромиелолейкоза человека (К-562) in vitro (Х ± m)

Время инкубации (часы)	Группы наблюдения
	К-562	К-562 + вирус ВЭЛ	К-562 + вирус оспо-вакцины	К-562 + вирус паротита
	% апоптотических клеток
3	15,8 ± 3,3	17,2 ± 6,2	21,3 ± 3,5	30,9 ± 4,2*
6	17,1 ± 6,5	16,2 ± 1,8	20,1 ± 2,8	31,1 ± 3,2*
24	10,5 ± 2,4	30,3 ± 5,8*	н.д.	12,4 ± 2,9

Примечания: К-562 – клетки эритромиелолейкоза человека; * – различия достоверны с группой «К–562» (р<0,05); н. д.– нет данных.

Материал и методы

Экспериментальные модели:

• -    К-562 – суспензионная культура клеток эритромиелолейкоза человека;

• -    клетки аденокарциномы Эрлиха (асцитный вариант).

Вирусные вакцины:

• -    вакцина паротитная, культуральная, живая, сухая, производства ФГУП «НПО Микроген», Московское подразделение по производству бактерийных препаратов;

• -    вакцина вируса осповакцины живая, сухая, производства НПО «Вирион» (Томск);

• -    аттенуированный штамм 2621 вируса венесуэльского энцефаломиелита, разработан в Томском НИИВС и прошел контроль как вакцинный препарат в ГИСК им. А. Тарасевича (Москва).

Индукцию апоптоза в опухолевых клетках регистрировали методом С.Н. Орлова (1996), который позволяет фиксировать дефрагментацию ДНК как конечную стадию апоптоза. Опухолевые клетки брали в концентрации 106/мл ростовой среды. Образцы помещали в планшеты, пробирки или флаконы (по 1,0 мл), добавляли 3H-тимидин (1 мкКи /50 мкл на пробу). Пробы инкубировали 24 ч при 37ОС в атмосфере 5 % СО2, после чего клетки 2-кратно отмывали и добавляли в каждую пробу по 1,0 мл свежей питательной среды. Далее инкубировали еще 24 ч, после чего в опытные образцы в качестве предполагаемого апоптоз-индуцирующего агента добавляли вирусные вакцины (104–105 ТЦД50) и инкубировали еще 3, 6 или 24 ч. Затем пробирки с пробами центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин, после чего осторожно снимали супернатант (1,0 мл), помещали в сцинтилляционную жидкость. В оставшуюся взвесь добавляли по 0,5 мл лизис-буфера SDS, переносили в виалы со сцинтилляционной жидкостью. Измерение радиоактивности проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике «Mark -3» (Trakor Analytic, USA) в импульсах/мин (cpm).

Количественную оценку апоптоза проводили по формуле

% апоптоза = 1,5 х ( A1t – A10)/ (A2 + A1t – 1,5 х A10) х 100%, где А1t – число имп./мин в супернатанте;

А2 – число имп./мин в осадке;

А10 – контроль до индукции апоптоза (число имп./мин в супернатанте).

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0. Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксо-на–Манна–Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее (Х), ошибку среднего (m). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При изучении апоптоз-индуцирующего действия вирусных вакцин на модели клеток

Таблица 2

Влияние вакцинных штаммов вирусов на апоптотическую гибель клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) in vitro (Х ± m)

Время инкубации (часы)	Группы наблюдения
	АКЭ	АКЭ +вирус ВЭЛ	АКЭ + вирус осповакцины
	% апоптотических клеток
3	18,8 ± 4,4	6,5± 1,5 *	36,1 ± 7,6 *
6	26,7 ± 4,9	19,6 ± 7,3	45,7 ± 7,3*
24	35,2 ± 7,7	13,3 ± 1,3*	46,7 ± 2,6