Изучение вклада генов аполипопротеина С-3 (АРОС-3) и аполипопротеина А-1 (АРОА-1) в состояние липидного профиля сыворотки крови человека

В настоящее время не вызывает сомнений, что одним из ведущих факторов проявления сердечнососудистых заболеваний является повышение концентраций общего холестерина в крови, и особенно холестерина, содержащегося в липопротеинах низкой плотности и триглицеридах.

Генетические факторы наряду со средовыми играют важную роль в детерминации нарушений липидного обмена в организме человека. Своевременная диагностика липидного спектра крови позволяет выявить на ранних этапах атеросклеротические изменения сосудистой стенки. Следовательно, стало необходимым изучение ассоциаций полиморфных вариантов генов, вовлеченных в регуляцию метаболизма липидов с основными показателями липидного профиля сыворотки крови человека.

Аполипопротеин А-1 (АРОА-1) представляет собой полипептид, содержащий 245 аминокислотных остатков с молекулярной массой 28,3 кДа [1].

АРОА-1 человека составляет около 70% общей массы белка в липопротеин е высокой плотно сти (ЛПВП), что указывает на его важную структурную роль. Аполипопротеин А-1 также участвует в обратном транспорте холестерина из периферических тканей в печень, обеспечивая связывание частицы ЛПВП с соответствующими рецепторами, обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и, как предполагается, может выступать в роли сигнальной молекулы [2]. В дополнение к этому, АРОА-1 является активатором фермента лецитинхолестеринацилтрансферазы (ЛХАТ), который участвует в реакции этерификации холестерина [1].

Ген, кодирующий аполипопротеин А-1 ( АРОА-1 ) локализован на хромосоме 11q23.1-q23.2. Известно, что главными местами экспрессии гена АРОА-1 и синтеза белка АРОА-1 у человека являются гепатоциты печени и энтероциты тонкой кишки. Экспрессия гена АРОА-1 обнаружена также в плаценте, сердце, хрящевой ткани [3].

Полиморфный вариант A-75G гена аполипопро теина А-1 (АРОА-1 ) обусловлен нуклеотидной заменой А на G в -75 позиц ии промоторной области описываемого гена.

Другим важным аполипопротеином, рассмотренным в рамках данной работы явился аполипопротеин С-3. Аполипопротеин С-3 – один из основных компонентов богатых триглицеридами липопротеинов (хиломикронов и липопротеинов очень низкой плотности), входит в состав липопротеинов высокой плотности. Содержит 79 аминокислотных остатков и имеет молекулярную массу 8764 кДа. В зависимости от количества молекул сиаловой кислоты различают три изопротеина, выявляемые при изоэлектрофокусировании [1]. Ген аполипопротеина С-3 ( АРОС-3 ) локализован на хромосоме 11q23.3 и находится в кластере генов АРОА-1 и АРОА-4 в пределах 15-кб. Экспрессируется главным образом в клетках печени [4]. Полиморфный вариант Sst I обусловлен нуклеотидной заменой С на G в 3238 положении 3' нетранслируе-мой области гена АРОС-3 .

Многочисленные исследования показывают связь между наличием описываемого полиморфного варианта Sst I гена АРОС-III с повышенной концентрацией белка АРОС-III и высоким уровнем триглицеридов (ТГ) [6-10] , а также с повышенным риском развития ИБС [11, 12].

Целью настоящего исследования явился анализ ассоциаций полиморфных аллелей гена аполипопротеина С-3 ( АРОС-3 ) и гена аполипопротеина А-1 ( АРОА-1 ) с основными показателями липидного профиля сыворотки крови человека.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В работе использованы образцы ДНК 282 здоровых индивидов в возрасте от 18 до 65 лет, проживающих на территории Республики Башкортостан. Образцы ДНК получены из цельной венозной крови после медицинского осмотра с письменного согласия испытуемых.

При анализе ассоциаций изученных полиморфных локусов с основными показателями липидного профиля вся исследованная выборка была разделена на группы в соответствии с показателями липидного профиля: 1 группа – лица, имеющие пока- затели липидного профиля в норме (156 чел.) и 2 группа – лица, имеющие показатели липидного профиля отличные от нормы (126 чел.).

Материалом для проведения биохимических анализов послужила сыворотка крови, взятая без следов гемолиза. Перед взятием крови испытуемые соблюдали строгую диету (минимум 12 ч). Кровь взята из вены. После осуществления забора крови сыворотка была отделена от эритроцитов и использована для проведения биохимических анализов.

Концентрация основных показателей липидного профиля: общего холестерина (ОХС), триглицеридов (ТГ), липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови определены ферментным методом реактивами фирмы “Cormay” (Германия) на анализаторе «Флюорат-02-АБЛФ-Т» (Россия).

Материалом для проведения молекулярногенетического исследования служили образцы ДНК, полученные методом фенольнохлороформной экстракции [13].

Анализ полиморфных ДНК-локусов : APOA-1 (A-75G) , APOC-3 (С3238G) осуществляли методом ПЦР-ПДРФ [5] с использованием соответствующих праймеров и специфических эндонуклеаз рестрикции [6].

Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 7% полиакриламидном и 1,5% агарозном гелях, окрашенных бромистым этидием с последующей визуализацией ДНК в УФ-свете.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения MS Excel XP (“Microsoft»), пакета программ SPSS (версия 13.0) [15]. Соответствие эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга оценивали по критерию χ² [14]. Варьирование концентраций ОХС у лиц с различными генотипами оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа. Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов как в выборке лиц, имеющих концентрации ОХС в норме, так и в группе лиц, имеющих высокие концентрации ОХС не выявлено достоверно значимых различий между мужчинами и женщинами. Поэтому при анализе ассоциаций половую принадлежность во внимание не принимали. С целью выявления ассоциаций изученных полиморфных вариантов рассматриваемых генов нами проведен сравнительный анализ двух групп, разделенных в соответствии со значениями ОХС.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта A-75G гена АРОА-1 выявил достоверное понижение аллеля APOA-I *A (Р=0.0486; χ ²=3.8904) и генотипа APOA-I *A/*А (Р=6.0233; χ ²=0.0148), а также повышение генотипа APOA-I *A/*G (Р=5.0463; χ ²=0.0206) в группе лиц, имеющих показатели ОХС выше нормы (табл.).

Таблица. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного варианта A-75G гена аполипопротеина А-1 (АРОА-1)

Частота генотипов и аллелей, % (р)

Группы	A/A		A/G		G/G		A		G
	n	pi±Si	n	pi±Si	n	pi±Si	n	pi±Si	n	pi±Si
Низкий уровень (ОХС<5,2 ммоль/л)	47	50,54±5,19	40	43,01±5,13	6	6,45±2,55	134	72,04±3,29	52	27,96±3,29
Высокий уровень (ОХС>5,2ммоль/л)	1	8,33+7,98	10	83,33±10,76	1	8,33+7,98	12	50±10,2	12	50±10,2
χ 2 (Р)	6,0233 (0,0148)		5,4063 (0,0206)		0,0005 (1,0005)		3,8904 (0,0486)

В результате однофакторного дисперсионного анализа было выявлено статистически значимое влияние генотипа АРОА-1 А/А (F=4,967; P=0,028) на понижение концентраций триглицеридов (ТГ).

Выявлено достоверное влияние аллеля АРОА-1 G (F=4,967; P=0,028) и генотипа АРОА-1 А/G (F=7,862; P=0,006) на повышение концентраций триглицеридов (ТГ).

В связи с имеющимися литературатурными данными об ассоциации C3238G гена аполипопротеина С-3 (АРОС-3) с атерогенными сдвигами липидного профиля: повышенным уровнем триглице- ридов, ЛПНП и аполипопротеина В [6-12], нами проведен поиск возможных ассоциаций данного полиморфного варианта с уровнем основных показателей липидного профиля.

В результате проведенного сравнительного и дисперсионного видов анализа нами не выявлено достоверно значимых различий между группой лиц, имеющих изученные показатели в пределах нормы и группой лиц, имеющих высокие уровни (или низкие в случае рассмотрения концентрации ЛПВП) показателей липидного спектра.

Таким образом, полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют о том, что генетические варианты генов аполипопротеина А-1 ( АРОА-1 ) и гена аполипопротеина С-3 ( АРОС-3 ) маркируемые как A-75G и C3238G вносят вклад в детерминацию нарушений метаболизма липидов. В частности у жителей Республики Башкортостан генетическими маркерами нарушений липидного обмена может являться аллель АРОА-1 G и АРОА-1 А/G .

Работа выполнена в «Центре молекулярногенетических исследований» при кафедре генетики БГПУ им. М. Акмуллы.