Изучение влияния аланина на накопление фенольных соединений в листьях цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.)

Исследования последних лет показали, что аминокислоты могут оказывать значительное влияние, прямое или косвенное, на физиологические параметры растений в процессе их роста и развития. Использование аминокислот в процессе выращивания является эффективным способом улучшения качества растительной продукции, а также предотвращения его снижения при хранении. Экзогенное применение аминокислот на различных сельскохозяйственных культурах способствовало увеличению урожайности, вегетативной массы, повышению содержания основных элементов питания в растениях [1, 2]. Аминокислоты являются не только строительным материалом в процессе биосинтеза белков, но и выполняют регуляторные функции в растении. В последние годы большое значение в сельском хозяйстве приобретают хелатные комплексы аминокислот с микроэлементами, наиболее перспективными в данном направлении являются глицин и аланин, поскольку они имеют небольшую молекулярную массу, образуют стабильные хелатные комплексы и используются растением во многих биосинтетических процессах, положительно влияющих на урожайность. Показано, что аминокислоты действуют как осмолиты, в связи с чем играют важную роль в открытии устьиц, повышении активности некоторых антиоксидантных ферментов, сохранении целостности биомембран, а также транспорте ионов [3, 4]. Выявлено положительное действие L-аланина на ризогенез у мяты перечной [5]. Показано, что внекорневое применение растворов индивидуальных аминокислот или их смеси на растениях, находящихся в условиях теплового, вододефицитного или солевого стресса, обеспечивало улучшение физиологических характеристик растений по сравнению с контролем, что, в свою очередь, способствовало увеличению урожайности и биохимических показателей получаемой продукции [6]. Вода с растворенными в ней действующими веществами поглощается с поверхности листьев через устьица и кутикулу, попадая через межклеточное пространство в стадиях развития растений, может способствовать повышению устойчивости растений к неблагоприятным абиотическим факторам. В связи с этим представляет интерес изучение влияния обработок различными аминокислотами на количественное содержание биологически активных соединений, динамику их накопления и качественный состав.

Цикорий обыкновенный – техническая культура, корни которой используются для получения инулина и производства кофезаменителей, а также различных функциональных пищевых продуктов и биологически активных добавок. При этом, надземная часть данного растения представляет интерес для изучения в качестве лекарственного растительного сырья в перспективе разработки на её основе препаратов гепатопротек-торного и иммуномодулирующего действия [9, 10].

Цель данного исследования заключается в сравнительном изучении воздействия рацемической смеси и левовращающего изомера аланина на накопление вторичных метаболитов (фенольных соединений) в листьях цикория обыкновенного.

Материалы и методы

Опыт проводили в 2021-2022 годах в опытном лекарственном севообороте лаборатории агробиологии ФГБНУ ВИЛАР. В течение периода проведения исследования (июнь-октябрь) ежедневно проводили учет среднесуточной температуры и количества осадков для определения значений гидротермического коэффициента. Расчет коэффициента проводили по формуле:

где R – сумма осадков за период с температурами выше 10 °C; I- - сумма температур за тот же период. Полученные данные приведены на рис. 1.

R x 10

I- проводящую систему растения [7]. Аминокислоты хорошо растворимы в воде, при поступлении в растение они не только принимают участие в метаболизме, но и выполняют защитную функцию в условиях абиотического стресса, который, в свою очередь, влияет на накопление вторичных метаболитов [8].

Таким образом, использование аминокислот и препаратов на их основе в качестве некорневой обработки на плантациях лекарственных растений является перспективным направлением исследований. Использование аминокислот в качестве дополнения к основному внесению элементов питания, в частности на критических

Рис.1.Среднедекадные значения гидротермического коэффициента за период проведения исследования

Fig.1.10-daysaverage values ofthe hydrothermal coefficientfor the studyperiod

Table 1. Scheme of experiment study the effect of alanine on the content of phenolic compounds in the leaves of common chicory

	L-аланин	DL-аланин (рацемат)
Год исследования:                Сорта: 2021 год                    Ростовский, 2022 год                  Ярославский-1	0 мг/л (контроль
	10 мг/л
	25 мг/л

Таблица 1. Схема опыта по изучению влияния аланина на содержание фенольных соединений в листьях цикория обыкновенного

В опыте использовались 2 сорта цикория обыкновенного – Ростовский и Ярославский-1. Растения цикория выращивали рассадным методом, 25-дневная рассада высаживалась в открытый грунт во 2 декаде июня. Схема посадки – 60×15 см. Через 20 дней проводили однократную некорневую обработку растворами аминокислот, в контрольном варианте использовали воду, схема опыта показана в таблице 1. Каждый вариант состоял из 3 повторностей по 15 растений. После обработки каждые 10 дней проводили отбор проб листьев, которые высушивали при температуре 35-38 °С. Отбирали неповреждённые вредителями и болезнями целые листья разного возраста – растущие и полностью сформированные. После высушивания пробы листьев каждого варианта измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 0,5 мм. Измельченные пробы использовали для проведения дальнейшего анализа.

Количественное определение суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту проводили методом прямой спектрофотометрии по разработанной ФГБНУ ВИЛАР методике на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) [11]. Каждый образец анализировали в трех повторностях.

Качественный состав фенольных соединений определяли методом ВЭЖХ-УФ-МС/МС с использованием системы LCMC-8040 (Shimadzu, Япония), включающей ультраэффективный жидкостный хроматограф Nex-era, тройной квадрупольный масс-спектрометр и диодноматричный детектор. Идентификацию веществ проводили на основании анализа характеристик УФ- и масс-спектров, их сравнением с индивидуальными соединениями, ранее полученными в ФГБНУ ВИЛАР, а также сопоставлением с данными литературы.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты и их обсуждение

На рисунке 2 показан схематичный график динамики накопления фенольных соединений в листьях цикория обыкновенного за период проведения исследования. Как видно из рис. 2, в онтогенезе цикория присутствуют два периода накопления фенольных соединений (ФС) – летний и осенний, между ними происходит значительное снижение содержания ФС. Это связано с биологическими особенностями растения – поскольку цикорий является двулетним видом, в первый год вегетации в условиях Московской области в 3 декаде августа происходит закладка генеративных почек, что приводит к перераспределению пластических веществ и отражается на синтезе вторичных метаболитов.

Общее содержание ФС в 2022 году было ниже по сравнению с 2021 годом в среднем на 0,7%. Это обусловлено различием погодных условий в периоды активного прироста вегетативной массы растений (рис. 1). Так, в июле и в конце сентября – начале октября в 2022 году сумма осадков была значительно выше по сравнению с 2021 годом, а температура воздуха в указанные периоды была ниже. Было установлено, что применение аланина в разных концентрациях не оказало значительного влияния на увеличение содержания фенольных соединений (табл. 2), изменений в динамике их накопления отмечено не было.

На рисунках 3 и 4 приведены ВЭЖХ-хроматограммы (ВЭЖХ-УФ-ДМД) спиртовых извлечений из листьев цикория. Фенольный комплекс листьев культивируемого цикория представлен фенолкарбоновыми кислотами, флавоноидами и следовыми количествами оксикумаринов [12]. Для наглядности на хроматограммах показаны данные об образцах разных сортов, полученных в разные годы исследования, обработанных растворами с разной концентрацией аминокислоты.

---Ростовский (2021) ---Ярославский (2021)

Рис.2.Динамика накопления фенольных соединений в листьях двух сортов цикория обыкновенного в 2021-2022 годах

Fig.2.Accumulation dynamics ofphenolic compoundsin the leaves oftwo varietiesofcommon chicoryin 2021-2022

Таблица 2. Содержание фенольных соединений в листьях цикория в период их максимального накопления (1 декада октября) Table 2. Phenolic compounds content in chicory leaves during their maximum accumulation (1st decade of October)

Погодные условия года (фактор А)	Действующее вещество (д.в.) (фактор В)	Концентрация д.в. (фактор С)	Содержание суммы фенольных соединений, % ( ͞х )
			сорт Ростовский	сорт Ярославский-1
		С1 - контроль	7,4481	7,5781
	В1 (L-аланин)	С2 (10 мг/л)	7,0745	7,3780
А1 (2021)		С3 (25 мг/л)	7,5660	7,1351
		С1 - контроль	7,4481	7,5781
	В2 (DL-аланин)	С2 (10 мг/л)	7,5398	6,9853
		С3 (25 мг/л)	7,1555	7,2571
		С1 - контроль	6,6308	6,4251
	В1 (L-аланин)	С2 (10 мг/л)	6,5717	5,7793
до (2022}		С3 (25 мг/л)	6,1851	6,2817
		С1 - контроль	6,6308	6,4251
	В2 (DL-аланин)	С2 (10 мг/л)	6,6230	6,3858
		С3 (25 мг/л)	6,4745	7,9165
	НСР 05 ABС		0,7156	0,5877

Было установлено, что применение растворов энантиомеров аланина не повлияло на качественный состав фенольных соединений, но привело к изменению соотношения гидроксикоричных кислот между собой (рис. 5). Различий по данным показателям между сортами цикория не обнаружено.

Как видно из рисунка 5, в 2021 году во всех вариантах по сравнению с контролем наблюдается увеличение содержания хлорогеновой кислоты за счет снижения цикориевой кислоты, при этом содержание кафтарововй кислоты и цикориина изменяется незначительно. В 2022 году подобное соотношение сохраняется только в вариантах с концентрацией аминокислоты 25 мг/л, тогда как варианты с 10 мг/л схожи по значениям с контролем. Как уже было сказано выше, погодные условия в период проведения исследования различались. Можно предположить, что при отсутствии стрессовых факторов, как в 2022 году, эффект от обработок возможен при использовании более высоких концентраций раствора аминокислоты (25 мг/л).

Цикориевая, хлорогеновая и кафтаровая кислоты являются основными фенольными соединениями в листьях цикория обыкновенного, на их долю приходится 50-60% общем профиле ФС. Данные соединения, а также

Рис.3.ВЭЖХ-УФ-хроматограмма (330 нм) спиртовых извлечений из листьев цикория – сорт Ростовский,2021 год Fig.3.Chromatogram (330 nm)ofalcoholextractsfrom chicory leaves- Rostovskyvariety,2021

Рис.4.ВЭЖХ-УФ-хроматограмма (330 нм) спиртовых извлечений из листьев цикория – сорт Ярославский-1,2022 год

Fig.4.Chromatogram (330 nm) ofalcohol extracts from chicoryleaves– Yaroslavskyvariety, оксикумарин цикориин, который составляет 1-2% от общего содержания ФС, обуславливают фармакологическое действие субстанций, полученных из листьев цикория – гепатопротекторное, противовоспалительное, анти-атеросклеротическое, иммуномодулирующее, антиоксидантное [13-16].

Установлено, что в течение вегетационного периода в листьях цикория изменяется процентное соотношение между основными фенольными соединениями (табл. 3). В начальный период роста (1 декада июля) отмечается высокое содержание цикориевой кислоты (> 80%), которое снижается к концу периода до 60-70%. Содержание хлорогеновой кислоты увеличивается пропорционально снижению цикориевой кислоты – с 9% до 20-30%. Содержание кафтаровой кислоты и цикориина изменяется незначительно. Данное соотношение в оба года исследования изменялось незначительно. В варианте с обработкой L-аланином в концентрации 25 мг/л за 2 года на обоих сортах было показано наибольшее снижение содержания цикориевой кислоты по сравнению с другими вариантами.

Хлорогеновая кислота является предшественником цикориевой [17] и, как видно из табл. 3, доля промежуточ-

Соотношение основныхдействующих веществе спиртовых извлечениях, % □ цикориевая кислота □ хлорогеновая кислота □ кафтаровая кислота Вцикориин

Рис.5. Соотношение основных действующих веществ в спиртовых извлечениях из листьев цикория в разные годы исследования на примере сорта Ростовский

Fig.5. The percentage ofthe main active ingredientsin alcoholextractsfrom common chicoryleaves in differentyearsofthe studyon the example ofthe Rostovskyvariety

Таблица 3. Соотношение основных фенольных соединений (%) в спиртовых извлечениях из листьев, отобранных в начале и конце вегетационного периода (2022 год)

Table 3. The ratio of the main phenolic compounds (%) in alcohol extracts from chicory leaves taken

at the beginning and the end of growing season (2022) Сорт Ростовский 1 декада июля (до обработки) Цикориевая 84 кислота Хлорогеновая кислота Кафтаровая кислота 96 Цикориин 2 1 декада октября Контроль 73 19 5 3 L-10 73 20 5 3 L-25 67 25 6 3 DL-10 75 17 5 3 DL-25 62 29 5 3 Сорт Ярославский-1 1 декада июля (до обработки) 82 9 8 1 1 декада октября Контроль 69 23 6 2 L-10 66 25 6 3 L-25 59 33 6 3 DL-10 68 24 5 2 DL-25 71 20 6 3 ного продукта, то есть хлорогеновой кислоты увеличивается осенью, то есть идёт её активный биосинтез с задержкой в превращении в конечный продукт, т.е. цико-риевую кислоту. Вероятно, это связано с тем, что в неблагоприятных условиях летней жары и осеннего похолодания увеличивается содержание суммы фенольных соединений, однако в зависимости от стрессового фактора накапливаются разные соединения.

Заключение

Анализ полученных экспериментальных данных позволяет сделать вывод о том, что применение энантиомеров аланина в разных концентрациях не оказало значимого влияния на динамику накопления фенольных соединений и увеличение их содержания в листьях цикория обыкновенного. Отмечено, что в год с неблагоприятными погодными условиями (повышенная температура воздуха, дефицит осадков) общее содержание фенольных соединений было выше в среднем на 0,7%. Также было установлено, что использование энантиомеров аланина при- вело к изменению соотношения гидроксикоричных кислот в спиртовых извлечениях из листьев цикория, но не повлияло на качественный состав фенольных соединений. В течение вегетационного периода в листьях цикория изменяется соотношение между фармакологически значимыми фенольными соединениями. Содержание хлорогеновой кислоты увеличивается пропорционально снижению цикориевой кислоты. Обработка L-аланином в концентрации 25 мг/л за период исследования на обоих сортах привела к наибольшему снижению содержания цикориевой кислоты по сравнению с другими вариантами. Таким образом, использование аланина при выращивании цикория с целью повышения содержания фенольных соединений не является рациональным агротехническим приемом. Однако дальнейшее изучение влияния других аминокислот на содержание биологически активных веществ и продуктивность растений цикория, безусловно, представляет интерес, и следует обратить внимание на фенилаланин, как предшественник фармакологических значимых соединений цикория.

Об авторах:

Aboutthe Authors:

Polina O. Mavrina – Junior Researcher Department of Chemistry of Natural Compounds, ,

Grigoriy V. Adamov – Leading Researcher laboratories of atomic and molecular bioregulation and selection, ,

Elena L. Malankina – Doc. Sci. (Agriculture),

Professor, Chief Researcher Laboratories Botanical Garden, ,