Изучение влияния биологически активных веществ на репродукцию перевиваемой линии культур клеток

На сегодняшний день быстрыми темпами развивается рынок новой биотехнологической продукции, получаемой благодаря перевиваемыми клеточными линиями, при этом особое внимание привлекают среди них среды, на основе которых выращивают продукты растительного и животного происхождения, в результате чего происходит увеличение объема производства питательных сред [1, 2].

Государственными организациями, контролирующими производство лечебнопрофилактических препаратов, было представлено распоряжение, ограничивающее уменьшение оборота производства вакцинных препаратов животного происхождения, вследствие того, что применение веществ зоогенной природы может привезти к реальной угрозе инфицирования прионами [4, 5].

В целях репродукции вирусов при изготовлении вакцинных препаратов, представленный апифитопрепарат может быть использован в качестве инициатора метаболизма при культивировании клеток животных в искусственной среде (in vitro) вследствие того, что взаимодействие апипродуктов с фитопрепаратами приводит к активации биологического воздействия отдельных компонентов [3].

Одной из актуальных задач биотехнологии является активация клеточного метаболизма, а также, вследствие мало изученности проблемы, влияния апифитопродуктов на рост и развитие животных клеток культивируя в искусственной среде в интересах вирусологических исследований, нами были проведены собственные научные работы [6].

Целью исследования является изучение влияния природных биополимеров на метаболизм культуры клеток.

Материал и методы исследований. В эксперименте моделью служили клетки перевиваемой линии Таурус-1 (почки теленка) из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» адаптированные к монослойному росту на питательной среде включающие: среды 199, МЕМ, ГЛА в соотношении 1:1:1 с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота, апифитоэкстракт, из расчета 1:9 цефриоксона в дозе 10 мкг/мл для ингибирования микробной контаминации. Перевиваемую линию клеток Таурус-1 эпителиоподобного типа культивировали в матрасиках. Для снятия клеток со стекла использовали раствор химопсина 50 мг в 500 см³ 0,04 % раствор Версена.

Все растворы приготовлены на деионизированной воде с сопротивлением 10-18 Мом.

В качестве потенциальных модуляторов роста культивируемых клеток in vitro применяли спиртовые и водные экстракты апифитоэкстракта «Вита-Форце».

Хитозан из класса биополимеров был использован в качестве контрольного препарата.

Собранные спиртовые экстракты подвергали деалкоголизации (очищению от экстрагента) посредством удаления на вакуумном ротационном испарителе до первоначального количества и нейтрализовали 0,1 н КОН до рН 7,2-7,4, после разводили стерильным физраствором до первичной плотности и употребляли в качестве добавки в ростовые питательные среды.

Из первичного сырья высушенного экстракта приготовили навески по 25, 30, 75, 100, 125, 150, 175 и 200 мг, в которые добавляли ростовые среды из расчета 25200 мг/л в целях испытания препарата в качестве катализатора клеточного обмена веществ. В 100 см3 чистой бидистиллированной воде, одновременно приготавливали водный раствор хитозана посредством разведения содержимого одной капсулы (220 мг). В ростовые среды из расчета 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 60, 90 и 100 см3/л добавляли ранее полученный 0,25 %-ный раствор хитозана.

По окончании определенной экспозиции состав колбы (спиртовый экстракт) с целью получения сухого экстрактивного вещества подвергали деалкоголизации посредством упаривания экстракта в вакуумном инкубаторе. Одновременно с этим получено 160± 5 мг % сухого вещества. Получившийся осадок вносили в ампулы по 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 мг/ см3.

Результат исследований. Результаты титрования оптимальных количеств апифитопрепарата при культивировании клеточной линии Таурус-1 на питательной среде Игла МЕМ представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 – Влияние апифитоэкстракт на рост и развитие клеток линии Таурус-1 в зависимости от содержания препарата в ростовой среде Игла МЕМ. Примечание: КК-концентрация клеток (х.105/мл), ИП - индекс пролиферации, ПС-питательная среда

Из данных видно, что питательная среда, содержащая апифитоэкстракт в концентрации 27,5 и 55,00 мг/л, при 48-часовом культивировании обеспечивала максималь- ный рост и развитие культуры клеток линии Таурус-1 до 9,0±0,05 – 9,1±0,011x105 клеток/ см3, при индексе пролиферации 3,2 и 3,3 соответственно, что в 2,52-2,57 раза выше

(Р≤0,001) по сравнению с данными 48часового культивирования клеток в среде без хитозана.

Увеличение концентрации апифито-экстракта в питательной среде до 110 мг/л не приводило к увеличению концентрации клеток в культуральной среде и пролиферативной активности клеток линии Таурус-1.

Одновременно во втором контрольном препарате на хитозане из класса природных биополимеров осуществляли эксперименты по оценке ростстимулирующей активности. Результаты титрования оптимальных количеств при культивировании клеточной линии Таурус-1 на питательной среде Игла МЕМ представлены в рисунке 2.

Рисунок 2 – Влияние хитозана на рост и развитие клеток линии Таурус-1 в зависимости от содержания препарата в ростовой среде Игла МЕМ

Результаты исследования показали, что питательная среда, содержащая хитозан в диапазоне концентраций 25,0-70,0 мг/л, обеспечивала максимальный рост и развитие клеток тест - культуры (Таурус-1), при котором концентрация клеток в культуральной среде через 48 ч (логарифмическая фаза) составляла 8,8±0,35 – 9,1±0,35×105 кл/см3 при индексе пролиферации 2,7-2,9 соответственно.

Заключение. Полученные результаты свидетельствует о том, что апифитоэкстракт может быть использован в качестве ростостимулирующего фактора. Использование клеток линии Таурус-1, стимулированного апифитоэкстрактом, обеспечивает повышение репродукции вирусов.

Резюме

Принимая во внимание высокую биологическую активность биополимеров, в частности хитина и хитозана, для культур клеток животных in vivo и in vitro осуществлены исследования. Цель работы является проработка влияния апифитоэкстракта на рост и размножение перевиваемых линий клеток TAURUS-1 после их рекриоконсервации при длительном хранении в жидком азоте.

Применение апифитоэкстракта в составе питательной среды при культивировании гидратированных линий клеток позволяло использовать метод рекриоконсервации клеток для размножения в них вирусов, используемых при производстве вирусвакцин.