Изучение загрязнённости чая и чайных травяных напитков микотоксинами (сообщение 2)

Микотоксины (МТ) – вторичные метаболиты плесневых грибов – являются глобальными загрязнителями пищевых продуктов, определяющими продовольственную безопасность для потребителя. Согласно исследованию Продовольственной и сельскохозяйственной организации (FAO), около 25 % продовольствия и кормов мирового производства загрязнены МТ [1], обладающими целым спектром негативных эффектов на организм человека – от иммунной супрессии до канцерогенеза.

Минимизация рисков, связанных с контаминацией продовольствия МТ, – одна из самых актуаль-

ных задач обеспечения безопасности пищи и здо-ровьесбережения повсеместно. Для ее реализации ведущими микологами и токсикологами всего мира была принята «Хартия по микотоксинам» (charter.mycokey.eu), призывающая нынешнее поколение ученых и специалистов к внедрению мер, гарантирующих снижение количества МТ в пищевых продуктах и повышение их безопасности ради безопасности будущих поколений [2]. Продуценты микотоксинов – плесневые грибы – чрезвычайно распространены и способны расти на разнообразных растительных субстратах в широком диапазоне условий окружающей среды. Токсинообразование возможно как в период вегетации, так и после сбора урожая, то есть охватывает все этапы технологической цепи (переработка, хранение, транспортировка). Содержание наиболее опасных МТ в пище (дезоксиниваленол (DON), Т-2-токсин, зеараленон (ZEA), охратоксин (ОТА), афлатоксин В1 (AFL B1), фумонизины (FB)) регламентируется в большинстве стран мира. В РФ нормативной базой являются ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции»1 и ТР ТС 015/2011 «О безопасности зерна»2, в методическую базу включено порядка четырех десятков ГОСТ и МУК, основанных на современных аналитических технологиях (иммуноферментный анализ ИФА, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС).

Применение хромато-масс-спектрометрии открывает новые перспективы для контроля безопасности пищевых продуктов, а в режиме мультидетекции позволяет выявлять в одном анализе несколько десятков видов контаминантов. Это особенно важно для мониторинга загрязненности пищевых продуктов метаболитами плесневых грибов, способных продуцировать десятки опасных соединений различной структуры [3–6]. В этом плане важно подчеркнуть, что знания о спектре метаболитов плесневых грибов постоянно расширяются. Сегодня в пищевых продуктах растительного происхождения, в основном производимых из зерновых, заинтересованными органами мониторируются не только регламентируемые МТ, но и их структурные производные (3- и 15-ацетил дезоксиниваленол, ниваленол, фузаренон Х – группа DON (трихотецены В); НТ-2-токсин, Т-2 триол (Т-2 triol), диацетоксискирпенол – группа Т-2-токси-на (трихотецены А); афлатоксины B2, G1, G2, стериг-матоцистин (STC) – аналоги AFL B1; зеранол, тале-ранол, α - и β -зераленолы – аналоги ZEA), микотоксины Alternaria (альтернариол (AOH), его метиловый эфир (AME), альтенуен, тентоксин (ТЕ)), а также эмерджентные микотоксины (ЭМТ: энниатины ENN

A и B, боверицин (BEA)) [7–10]. Но сведения о распространенности нерегламентируемых и малоизученных МТ в пище, об их негативных воздействиях в малых дозах, в том числе при хроническом совместном поступлении в организм человека пока недостаточны. Это определяет актуальность широких исследований растительной продукции массового потребления, в том числе чая.

Традиционный чай на основе растения Camellia sp. является одним из наиболее употребляемых напитков во всем мире и обычно ассоциируется с понятиями пользы, здоровья и безопасности. В то же время климатические условия субтропиков, благоприятные для культивирования чайного куста, способствуют и токсинообразованию у плесневых грибов. Зафиксированы случаи обнаружения в чае FB, OTA, AFL, ZEA, трихотеценовых МТ, цитринина на уровне десятков и даже сотен мкг/кг [11]. Риски, обусловленные контаминацией чая МТ, информация об уровнях загрязнения различных видов чая, а также аналитические методы определения МТ в этом виде продукции детально были рассмотрены авторами в обзоре [11]. Там же собраны сведения о подходах к регулированию МТ в чае в различных странах. Так, на сегодняшний день в чае регламентируются только AFL В1 или общее содержание AFL. Максимальные допустимые уровни (МДУ) введены в Аргентине, Индии, Шри-Ланке, Японии и Китае на уровне от 5 до 30 мкг/кг. Согласно ТР ТС 021/2011, в странах ЕАЭС установлен МДУ для AFL В1 в сухом чае – 5 мкг/кг , не более.

Не менее популярным продуктом являются травяные чаи, потребление которых в последнее время возрастает. Зачастую они содержат лекарственные растения (мята, ромашка, крапива, солодка, шиповник и др.) и позиционируются производителями как «продукты для здоровья». Однако в аналогичных по составу БАД к пище нередко обнаруживают AFL, OTA и вторичные метаболиты Alternaria [12]. До настоящего времени систематические исследования загрязненности чая МТ в РФ не проводились.

Ранее авторами были получены данные об уровнях и частоте загрязненности плесневыми грибами более 50 образцов чая (черный, зеленый, травяной и др.) [13]. При анализе видового состава плесневых грибов в группе чаев Camellia sp. максимальные уровни загрязнения во всех образцах определялись грибами рода Aspergillus с доминированием комплекса Aspergillus секции Nigri. В группе травяных чаев (напитков) помимо представителей данного комплекса, который также обусловливал высокие уровни кон- таминации, были обнаружены Penicillium sp., Alter-naria sp., Fusarium sp., Cladosporium sp., отдельные виды которых являются токсинопродуцирующими. Это позволяет предположить присутствие в чаях МТ, продуцируемых этими видами плесеней. В настоящее время дискутируется вопрос о микробиологических показателях по плесеням, установленным для чая в Российской Федерации, и возможности их снижения в целях гармонизации с международными требованиями.

Целью настоящих исследований было изучение частоты и уровней контаминации различных видов чая, включая травяные, широким спектром токсических метаболитов: МТ, регламентируемыми в пищевых продуктах растительного происхождения (AFL B1, B2, G1, G2; OTA, DON, FB1, FB2, T-2, ZEА), их производными и структурными аналогами (DAS, HT-2, Т-2 triol, NeoS – производные Т-2 токсина; 3- и 15-AcDON, NIV, FusX - производные DON; a -, p -ZEL, a -, p -ZAL - производные и аналоги ZEA), а также эмерджентными МТ (STC, MPA, MO, EnnA и В, BEA, AOH и AME, TE). В задачи также входило выявление корреляции содержания МТ в образцах чая с уровнем их плесневой контаминации; исследование токсиногенных свойств микофлоры чая в условиях in vitro , наиболее приближенных к естественным .

Материалы и методы. Исследовано 77 образцов чая: 30 образцов нефасованного традиционного чая ( Camellia sp.) (полуфабрикат), из них 26 черного и четыре зеленого, из шести чаепроизводящих регионов (Вьетнам, Индия, Индонезия, Кения, Китай, Шри-Ланка), предоставленных торгово-оптовыми компаниями; 22 образца фасованного традиционного черного, зеленого чая ( Camellia sp .) и чая с добавками; два образца чая пуэр; 23 образца травяных чаев, среди которых монокомпонентные (суданская роза, кипрей ферментированный, чабрец, мята) и многокомпонентные, состав которых представлен в табл. 1. Образцы фасованного чая получены из розничной торговой сети.

Определение 29 микотоксинов проводили методом высокоэффективной хроматографии ультравысо-кого давления с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (УВЭЖХ-МС/МС) в режиме мультидетекции с использованием УВЭЖХ Vanquish (бинарный насос, автосамплер и термостат), совмещенной с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором с подогреваемым электро-распылительным источником TSQ Endura, программное обеспечение Xcalibur 4.0 QF2 Software (Thermo Scientific, USA).

Разделение аналитов осуществляли на обращенно-фазовой колонке с привитыми группами ок-тадецилсилана Titan C18, 2,1*100 мм, 1,9 ц т (Supelco, PA, USA) в режиме градиентного элюирования. Подвижная фаза А: MeOH-вода (10 %об.), подвижная фаза Б: MeOH-вода-ацетонитрил (10/10/80 %об.). Обе фазы были модифицированы: 1 мM формиата аммония и 0,1%-ной муравьиной кислоты. Схема градиента: старт и до 1 мин – 0 % В, от 1 до 2 мин –

Таблица 1

Состав многокомпонентных травяных чаев

№ образца Компонентный состав смесей 2 Кипрей, смородина 8 Плоды боярышника, побеги омелы белой, трава донника, трава пустырника, корень валерианы 9 Эхиницея, душица, мята перечная, крапива, чабрец, ромашка, шиповник, шалфей, фиалка, солодка 10 Трава чабреца, зверобоя 11 Ромашка, листья мяты перечной, цветки бессмертника песчаного, цветы пижмы, плоды кориандра, расторопша лист мяты, трава донника, плоды шиповника, корень девясила, плоды боярышника 12 Череда, календула, репешок, бессмертник, ромашка, зверобой, береза 14 Кипрей, брусника 19 Трава лимонная, мирт лимонный, корень имбиря, лакрицы, цедра лимона 20 Ромашка, мята 36 Кипрей, облепиха 38 Кипрей, липа линейный рост до 15 % В, от 2 до 5 мин – до 30 % В, от 5 до 13 мин – до 70 % В, от 13 до 14 мин – 90 % В, от 14 до 16,5 – 95 % В, до 17 мин – рост до 100 % В и удерживание в течение 3 мин, с 20,0 по 20,5 мин – снижение содержания В до 0 % и уравновешивание колонки до 22,0 мин. Объемная скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин. Температура колонки 30 °С. Объем ввода образца 2–4 мкл. Продолжительность анализа 22 мин. Детектирование аналитов осуществляли в условиях электрораспылительной ионизации с активацией соударением в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Оптимизацию условий детектирования проводили в автоматическом режиме путем ввода стандартных растворов МТ в поток подвижной фазы, соответствующей времени удерживания аналита. Параметры детектирования, значения минимальной определяемой концентрации (МОК) МТ в чае, рассчитанные по 10о-критерию, и средние степени извлечения приведены в табл. 2.

Стандартные растворы 29 МТ готовили из сухих стандартов AFL B1, AFL B2, AFL G1, AFL G2, STC, T-2- и HT-2-токсинов, DAS, NIV, DON, 3- и 15-AcDON, FusX, FBI, FB2, ZEA, a - и p -ZEL, a -ZAL, OTA (Sigma Aldrich); AOH, AME, BEA, EnnA, EnnB, MPA, MO, NeoS, T-2 triol, TE (Fermen-tek, Jerusalem, Israel). Стандартные растворы хранения готовили в ацетонитриле (AFLs, STC, трихоте-цены групп A и B, ZEA и аналоги, OTA, MPA), метаноле (токсины Alternaria , энниатины, ВЕА, MPA, MO) или смеси «ацетонитрил / вода» – 50/50 (% об.) – FB1, FB2 с концентрацией 100 или 500 мкг/мл. Из стандартных растворов готовили мультистандарт и калибровочные растворы. Все стандартные растворы хранились при –18 °C.

Таблица 2

Характеристики УВЭЖХ-МС/МС определения МТ в чае

№ п/п	МТ	tR , мин	Материнский ион, m/z		Напряж. фрагм., V	Дочерние ионы, m/z (энергия соудар., V)	МОК, мкг/кг	Степень извлеч., %
1	MO	0.7	[M-H]–	97	54	41 (12), 80 (23)	800	76
2	NIV	1.8	[M+H]+	313	100	125 (10), 177 (10)	1000	81
3	DON	2.9	[M+H]+	297	100	203 (18), 231 (12), 249 (11)	1250	63
4	FusX	3.6	[M+H]+	355	103	175 (20), 229 (16), 247 (12)	100	80
5	NeoS	3.9	[M+NH 4 ]+	400	79	185 (17), 203 (17), 215 (18), 305 (10)	<10	75
6	AcDON	4.6	[M+H]+	339	97	203 (17), 213 (18), 231 (13)	250	94
7	T-2 triol	4.8	[M+NH 4 ]+	400	76	215 (10), 263 (13)	250	75
8	AFLG2	6.2	[M+H]+	331	170	189 (41), 245 (30), 313 (24)	4	79
9	AFLG1	6.6	[M+H]+	329	150	200 (41), 243 (26), 311 (21)	4	85
10	AFLB2	6.8	[M+H]+	315	170	243 (39), 259 (29), 287 (26)	4	85
11	DAS	6.9	[M+NH 4 ]+	384	89	247 (14), 307 (10), 349 (10)	20	95
12	AFLB1	7.3	[M+H]+	313	166	213 (45), 241 (37), 285 (22)	4	85
13	AOH	8.0	[M+H]+	259	100	128 (44), 184 (30), 213 (27)	1000	87
14	HT-2	8.0	[M+NH 4 ]+	442	91	215 (10), 263 (10)	500	77
15	FB1	8.0	[M+H]+	772	217	334 (40), 352 (36)	400	44
16	a -ZAL	8.3	[M+H]+	323	66	189 (22), 305 (10)	125	76
17	TE	8.3	[M+H]+	415	130	302 (13), 312 (19)	4	78
18	P -ZEL	8.5	[M+H]+	321	88	189 (20), 303 (10)	1000	88
19	MPA	8.9	[M+H]+	321	113	207 (22), 275 (16)	50	101
20	a -ZEL	9.5	[M+H]+	321	65	189 (22), 303 (11)	1000	84
21	T-2	9.7	[M+NH 4 ]+	484	137	215 (17), 305 (13)	10	100
22	FB2	9.7	[M+H]+	706	150	318 (36), 336 (36)	100	73
23	OTA	10.4	[M+H]+	404	123	221 (35), 239 (24), 358 (14)	2,5	78
24	AME	10.5	[M+H]+	273	150	185 (40), 199 (40), 258 (30)	750	87
25	ZEA	10.5	[M+H]+	319	90	185 (20), 283 (10), 301 (10)	150	86
26	STC	10.9	[M+H]+	325	152	253 (44), 281 (36), 310 (24)	4	78
27	EnnB	15.1	[M+H]+	657	142	196 (30), 214 (31), 527 (27), 640 (17)	2,5	73
28	BEA	15.5	[M+NH 4 ]+	801	215	244 (32), 262 (30), 784 (17)	2,5	80
29	EnnA	16.2	[M+H]+	699	255	210 (24), 228 (24)	6	92

П р и м е ч а н и е: жирным шрифтом выделены дочерние ионы, выбранные для количественного анализа.

Подготовка проб сухого чая к анализу МТ. Представительную пробу (10–20 г) образца сухого чая измельчали. К навеске 1,0 г добавляли 10 мл экстрагента (ацетонитрил / вода / муравьиная кислота – 80/20/0,5 % об.), встряхивали в течение 30 мин, центрифугировали, 1 мл супернатанта разбавляли 1 мл подвижной фазы А. Разбавленную пробу после перемешивания центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 об/мин. Супернатант объемом 1,5 мл помещали в хроматографическую виалу для анализа.

Исследование токсинообразования в условиях in vitro проводили на питательной среде на основе голодного агара со стрептомицином (200 мг/л), содержащей в качестве единственного субстрата 6 % измельченного сухого чая. Для этого использовали микробиологически чистый зеленый чай (менее 10 КОЕ/г плесеней и бактерий), не содержащий МТ, из числа исследованных ранее. Предварительно чай измельчали в мельнице с использованием стерильных одноразовых камер и асептически вносили в расплавленный голодный агар при температуре 40 ± 1 ° С. В качестве инокулятов использовали смывы с образцов сухого чая (10 г чая в 90 мл стерильного фосфатного буфера), которые вносили в чашки

Петри по 1 мл и заливали питательной средой. После 10 суток инкубирования при 24 ºС содержимое каждой чашки Петри (мицелий с агаризованной средой – субстратный мицелий) тщательно перемешивали и по 1 г вносили в пробирки для последующей экстракции микотоксинов.

Подготовка проб субстратного мицелия к анализу МТ. В каждую пробирку с 1 г образца добавляли 5 мл экстрагента (см. «Подготовка проб сухого чая к анализу МТ»), тщательно перемешивали и выдерживали 30 мин в ультразвуковой бане, после чего 10 мин центрифугировали при 4000 об/мин, отбирали 1 мл супернатанта, к которому добавляли 1 мл подвижной фазы А, после перемешивания повторно центрифугировали при 10 000 об/мин 10 мин. Супернатант объемом 1,5 мл помещали в хроматографическую виалу для анализа.

Результаты и их обсуждение. Скрининг микотоксинов в образцах чая. Исследование МТ и ЭМТ в образцах нефасованного традиционного чая (Camellia sp.) из шести чаепроизводящих регионов – Китая, Индии, Индонезии, Шри-Ланки, Вьетнама и Кении – показал, что из 29 исследованных МТ в пробах были обнаружены восемь: AFL G2 – представи- тель афлатоксинов и STC – биогенный предшественник AFL B1; трихотеценовые МТ – FusX, NeoS, T-2; часто обнаруживаемые совместно фузариоток-сины – EnnB и BEA, а также распространенный контаминант растительного сырья – MPA (табл. 3). В 20 из 30 (66,7%) исследованных образцов были обнаружены МТ, среди которых с набольшей частотой выявлялись эмерджентные МТ: BEA в 18 образцах из 30 (60 %), далее по убыванию FusX, EnnB, NeoS, продуцируемые в основном Fusarium sp. В подавляющем большинстве «положительных» проб содержание МТ не превышало МОК, установленных в методике анализа (см. табл. 2). В количестве 200 мкг/кг – в 4 раза превышающем МОК, только в одном образце была обнаружена МРА. Превышения установленного норматива по AFL B1 зафиксировано не было. Наиболее контаминированными оказались образцы черного чая из Вьетнама и Индонезии, далее по убыванию: из Индии, Китая, Кении и Шри-Ланки. В зеленом чае из Китая МТ были обнаружены только в одном образце.

Результаты в общем коррелировали с данными микологических исследований этих образцов [13]. В чаях с низким уровнем плесеней (<103 КОЕ/г), полученных в основном из Шри-Ланки, Кении и Китая, обнаруживалось меньше видов МТ, а в образцах с более высоким уровнем ((1,5–2,3)·103 КОЕ/г) из Индонезия и Индии – больше. Исключение составили микробиологически чистые (<102 КОЕ/г) образцы из Вьетнама, в которых число видов МТ было сравнимо с таковыми в чае из Индонезии. Прямая зависимость содержания МТ и их продуцентов более характерна для свежих образцов, по мере хранения происходит постепенное отмирание жизнеспособных форм плесеней, выявляемых в микологическом анализе, в то время как синтезированные ими МТ остаются в чае (табл. 3).

При скрининге МТ и ЭМТ в образцах фасованного чая ( C. sinensis ): зеленого, черного и чая с добавками в 20 из 24 (83%) исследованных образцов выявлено 12 видов МТ с преобладанием ЭМТ. Среди последних с наибольшей частотой обнаруживались BEA и МРА – в 13 из 24 образцов (56 %), с меньшей AcDON и FusX – в 6 и 5 соответственно, и в единичных случаях – NEOS, STC, Enn B, AME и TE (табл. 4). Выявленные количества ВЕА, МРА и ТЕN с превышением МОК в черных чаях и пуэр были сопоставимы с уровнями, встречающимися в других растительных продуктах [7, 14]. Из опасных МТ в следовых количествах были обнаружены афлатоксины: AFL B1 в образцах черного листового и AFL G2 – черного пакетированного. STC – биогенный предшественник AFL B1, отнесенный МАИР к потенциально канцерогенным соединениям [15] – обнаружен в двух образцах черного чая: листовом и с чабрецом, в последнем в количестве 4,4 мкг/кг, что сопоставимо с МДУ, установленным в ТР ТС 021/2011 для AFL B1 в чае – не более 5 мкг/кг.

Результаты анализа образцов чая пуэр не показали ожидаемого разнообразия МТ, при этом и количество исследованных образцов было незначительным. Чай пуэр традиционно получают путем длительной, более 10 лет, ферментации зеленого чая, на протяжении которой происходит глубокая трансформация исходной микрофлоры чайного листа, что само по себе может привести к созданию условий для накопления некоторых МТ: например, патулина [16], AFL, DON [17], OTA [18]. При употреблении этого чая принято сливать первую заварку, а употреблять только следующую. В настоящее время способ долговременной ферментации вытесняется более технологичной ускоренной ферментацией (pile fermentation), которая сокращается до 48 дней [18]. Результаты анализа показали в одном из образцов

Таблица 3

Обнаружение МТ в образцах нефасованного чая ( Camellia sp. ) из шести чаепроизводящих регионов

Микотоксин

Вьетнам, n = 5

Индонезия, n = 5

Индия, n = 5

Китай, n = 5

Шри-Ланка, n = 5

Кения, n = 5

1 ] 2 ] 3 ] 4 ]

5

1 ] 2 ] 3 ] 4 ]

5

1234 ]

5

1 1

2* 3* 4*

5*

12 ] 3 ] 4 ]

5

1 ] 2 ] 34 ]

5

МТ, регламентируемые в пищевой продукции

T-2

– 1

– 1

+ 1

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

+ 1

–

–

–

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

–

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

– 1

–

– 1

–

ЭМТ:

AFL G2

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

STC

+

–

–

–

–

+

+

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

FusX

–

–

–

+

+

–

–

–

+

–

–

–

–

+

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

+

–

–

–

NeoS

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

MPA

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

+

–

200*

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

EnnB

–

–

+

+

–

+

–

–

–

–

–

–

+

+

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

–

BEA

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

–

–

+

+

+

+

+

–

–

–

+

+

–

–

–

+

–

–

–

–

Суммарная частота обнаружения МТ, абс.

12

11

8

5

2

2

П р и м е ч а н и е: * – образцы зеленого чая; ** – содержание МТ выше МОК – 200 мкг/кг; « + » – содержание МТ выше ПО, но ниже МОК (следы); « – » – МТ не обнаружены.

Таблица 4

Микотоксин	Образцы фасованного чая ( n – число образцов)
	зеленый листовой, n = 1	зеленый пакетир., n =3	черный листовой, n =10	черный пакетир., n =6	пуэр, n =2	черный с чабрецом пакетир., n =2
	Количество образцов чая, содержащих МТ*
Всего образцов чая, содержащих МТ	1	3	7	6	2	1
МТ, регламентируемые в пищевой продукции
AFL B1	–	–	1	–	–	–
T-2	1	–	–	1	–	–
Структурные аналоги регламентируемых МТ
AFL G2	–	–	–	1	–
STC	–	–	1	–	–	1 (4,4**)
AcDON	–	2	3	–	1	–
FusX	–	–	2	3	–	–
NeoS	–	–	2	–	–	–
ЭМТ
MPA	–	3	4	3 (до 200)	2 (до 3040)	1
BEA	–	2	4 (до 6,0)	5	1	1
EnnB	–	–	–	–	–	1
AME	–	1	–	–	–	–
TE	–	–	–	1 (10)	–	–

П р и м е ч а н и е: * – МТ в количествах выше ПО, но ниже МОК (следы); ** – в скобках указано содержание МТ (диапазон кон-центраций) в образцах выше МОК, мкг/кг; « – » – МТ не обнаружены.

Обнаружение МТ в образцах фасованного чая ( Camellia sp .)

чая пуэр значительное количество МРА (30,4 мкг/кг). Известно, что МРА продуцируется грибами рода Penicillium [19] , так называемыми «грибами хранения», и может накапливаться в продукте уже после сбора урожая при нарушении условий хранения [20]. Показатели безопасности для чая с длительной ферментацией типа пуэр четко не определены, а микробиологические нормативы, рекомендуемые для чая Европейской ассоциацией Tea & Herbal Infusions Europe (THIE, 2018), не распространяются на чаи пуэр [21]. По полученным ранее результатам микробиологических исследований все образцы фасованного чая ( Camellia sp. ), в том числе с добавками, соответствовали нормативу [13]. Ни в одном образце не был обнаружен AFL B1 выше установленного норматива.

Травяные чаи были представлены двумя выборками образцов: монокомпонентные и многокомпонентные. Из 12 образцов монокомпонентных травяных чаев (чабрец, мята, кипрей, каркаде) в восьми (66,6 %) были обнаружены 10 из 29 исследованных МТ (табл. 5), среди которых преобладали ЭМТ: на первом месте BEA и МРА, далее в прядке уменьшения: Enn B и ТЕ, AME, Enn А, DAS, FuzX, STC. Из регламентируемых в пищевых продуктах МТ в двух образцах кипрея был обнаружен DON на уровне ниже МОК. По видам сырья наиболее контаминированными оказались чабрец и кипрей. В образцах чабреца содержались все девять нерегламентируе-мых МТ, выявленных в этой группе чая, а пять из них – в количествах, превышающих МОК. Возможно, присутствие именно этой добавки обусловило содержание STC (4,4 мкг/кг) в одном из образцов фасованного черного чая с чабрецом (табл. 3).

По результатам микробиологических исследований, полученным ранее [13], наиболее загрязнены плесневыми грибами были образцы чабреца, а также мяты, по два из которых не соответствовали установленному нормативу, количество плесеней в них достигало 105 и 106 КОЕ/г соответственно; во всех образцах кипрея, ромашки и каркаде содержание плесеней было в пределах норматива. В образцах кипрея низкое количество плесеней – 50 КОЕ/г – было на фоне высокого уровня спорообразующих бактерий – 106–8 КОЕ/г, отдельные виды которых, как известно, обладают антагонистической активностью в отношении плесеней как следствие микробной коммуникации бактерий и грибов, сложившейся в процессе эволюционного развития при конкурентном освоении экологических ниш и борьбе за субстрат [22]. Однако присутствие МТ в образцах кипрея свидетельствует о наличии плесневой контаминации, на ранних стадиях. Поэтому низкие уровни или даже отсутствие жизнеспособных форм плесеней при микологическом анализе не означает отсутствие МТ в продукции, однако высокие уровни в большинстве случаев обусловливают наличие МТ.

Вторая группа – многокомпонентные травяные чаи (чайные напитки) была представлена 11 образцами, состав которых приведен в табл. 1. Многокомпонентные травяные чаи оказались в значительно более высокой степени загрязненными МТ: в 10 (91 %) образцах этой группы из 11 были обнаружены 18 из 29 исследованных МТ (табл. 6), причем в шести (54 %) образцах совместно обнаружены от семи до восьми МТ. Содержание МТ в этих образцах значительно превышало уровни контаминации в остальных изученных группах чая. Среди ЭМТ чаще других

Таблица 5

	Микотоксин	Травяной чай
		чабрец, n = 4	кипрей, n = 5	мята, n = 2	каркаде, n = 1
		Количество образцов, содержащих МТ*
Всего образцов, содержащих МТ		4                     1	3 {	1 {	–
МТ, регламентируемые в пищевой продукции
DON                       1		–	2 1	–	–
Структурные аналоги регламентируемых МТ
STC		1 (24**)	–	–	–
FusX		1	–	–	–
DAS		1	–	–	–
ЭМТ:
MPA		2 (до 100 мкг/кг)	2	–	–
BEA		2 (до 4 мкг/кг)	1	1	–
EnnA		1	–	–	–
EnnB		2 (до 26 мкг/кг)	1	–	–
AME		2	–	1	–
TE		2 (до 13 мкг/кг)	–	1	–

П р и м е ч а н и е: * – содержание МТ выше ПО, но ниже МОК (следы); ** – в скобках указано содержание МТ (диапазон концентраций) в образцах выше МОК, мкг/кг; «–» – МТ не обнаружены.

Обнаружение МТ в образцах монокомпонентных травяных чаев

обнаруживали MPA, а также метаболит Alternaria – TE: в девяти и семи образцах из 11 соответственно, далее в порядке уменьшения частоты обнаружения: BEA, EnnB и STC в шести образцах, AME – в пяти; EnnА – в трех; β -ZEL – в двух. В единичных случаях детектировали AFL G1, T-2-triol, DAS, ZEA и FusX. В отличие от других исследованных видов чая, в травяных было выявлено значительно больше опасных регламентируемых МТ: AFLB1, OTA, DON, T-2, FB2, ZEA, при этом на уровнях, близких к нормируемым значениям в пищевой продукции. Так, ОТА, обнаруженный в количестве 2 мкг/кг (образец № 19), согласно ТР ТС 021/2011, не допускается в количестве более 5 мкг/кг в детских кашах, а в Европейском союзе на том же уровне и в кофейных зернах; FB2 – 100 мкг/кг (образец № 10) – не допускается в количестве более 200 мкг/кг в детских кашах; Т-2 токсин – 9,2 мкг/кг (образец № 12) – не допускается более 50 мкг/кг в детских кашах; ZEA – 190 мкг/кг (образец № 8) – не допускается более 200 мкг/кг в пшеничной муке.

Сочетанная контаминация травяных чаев несколькими видами МТ свидетельствует о развитии в растительном сырье токсигенных микромицетов как на этапе вегетации растений («полевые грибы»: Fusarium sp. - DON, 3- и 15-AcDON, T-2, Т-2-triol, DAS, ZEN, β-ZEL, EnnA и В, BEA, FB1 и FB2 и Alternaria sp. – AOH, AME, TEA, TE), так и на этапах переработки и хранения («грибы хранения»: Aspergillus sp. – AFB1, AFG1, AFG2, STC, OTA, Penicillium sp. – MPA, OTA), что согласуется с результатами микологических исследований этих образцов [13].

В выборке многокомпонентных травяных чаев в пяти образцах (№ 8–12) (табл. 6) большое разнообразие МТ выявлено на фоне высоких уровней плесеней 104–105 КОЕ/г. Однако в образце № 19

(см. табл. 6) восемь видов МТ были обнаружены на фоне низкого количества плесеней (50 КОЕ/г) и высокого количества спорообразующих бактерий (8·105 КОЕ/г) [13], подобные результаты были получены и для образцов кипрея (см. табл. 5), что свидетельствует о первичной грибной контаминации, подавленной развитием бактерий. Таким образом соответствие образцов чая установленным в ТР ТС 021/20111 требованиям микробиологической безопасности не означает отсутствия в них МТ.

Рост числа выявленных МТ также совпадал с увеличением числа компонентов (см. табл. 1 и 6). Видовое разнообразие МТ в травяных чаях было значительно более широким по сравнению с чаями Camelia sp . Такая картина отмечалась и другими исследователями для этой группы продукции. Анализ 60 травяных чаев в Латвии показал наличие 12 МТ, в 90 % образцов содержалось от 1 до 8 видов МТ, наиболее часто выявлялись EnnB, DON, AFB1, OTA, ZEA [23]. По данным исследований из 84 образцов лекарственных и ароматических трав в Испании 99% были загрязнены МТ, среди которых преобладали OTA, FB, AFL, ZEN, T-2, DON, цитри-нин [24]. Такое разнообразие МТ отмечалось и при анализе луговых трав, являющихся природным ареалом для формирования микробных сообществ. Так, при исследовании более 500 образцов были выявлены 16 видов МТ: Т-2, DAS, DON, ZEА, FВ, АОН, роридин А, АFL В1, STC, циклопиазоновая кислота, эмодин, ОTА, цитринин, MPA, PR-токсин, а также эргоалкалоиды [25].

ЭМТ в наших исследованиях обнаруживались во всех видах чая, c наибольшей частотой среди них выявлялись BEA, МРА, EnnB, TE, FusX (табл. 7). Следует заметить, что структурно близкие BEA и эн-ниатины широко распространены и встречаются

Таблица 6

Микотоксин	Образцы многокомпонентных травяные чаев
	№14	№2	№36	№38	№20	№19	№8	№9	№10	№11	№12
МТ, регламентируемые в пищевой продукции
AFL B1	–	–	–	–	–	+	–	–	–	–	–
OTA	–	–	–	–	–	2,0*	–	–	–	–	–
DON	–	–	–	–	–	+	–	–	–	–	–
T–2	–	–	+	–	–	–	–	–	–	–	9,2
FB2	–	–	–	–	–	–	–	–	100,0	–	–
ZEA	–	–	–	–	–	–	190,0	–		–	–
Структурные аналоги регламентируемых МТ
AFLG1	–	–	–	–	–	3,2	–	–	–	–	–
STC	–	–	–	–	–	+	8,0	+	10,0	9,2	9,6
FusX	–	–	–	+	–	–	–	–	–	–	–
T-2 triol	–	–	–	–	–	–	–	–	–	–	+
DAS	–	–	–	–	–	–	–	–	–	+	–
β -ZEL	–	–	–	–	+	–	–	+	–	–	–
ЭМТ:
MPA	–	–	+	+	+	+	770	690	1760	440	2240
BEA	–	–	–	–	–	20,4	6,0	5,6	5,6	8,0	8,0
EnnA	–	2,8	–	–	–	–	–	+	–	+	–
EnnB	–	–	–	–	–	13,6	22,4	52,0	34,0	55,0	36,0
TE	–	+	–	–	5,6	–	6,0	5,2	5,2	9,2	6,4
AME	–	–	–	–	–	–	+	+	+	+	+

П р и м е ч а н и е: * – содержание МТ указано в мкг/кг; «+» – содержание МТ более ПО, но менее МОК (следы); «–» – МТ не обнаружены.

Таблица 7

Группа чаев	Доля образцов, содержащих МТ, %	Число обнаруженных видов МТ, абс.	Микотоксины в порядке уменьшения частоты встречаемости
C. sinensis нефасованные (полуфабрикат)	70	8	BEA > FusX > EnnB > STC > MPA >  T-2 > (AFL G2, NeoS)*
C. sinensis фасованные	83	12	(BEA, MPA) > AcDON > FusX > ( T-2 , NEOS) > (EnnB, АМЕ, TE, STC, AFL B1 и G2)
Травяные монокомпо-нентные	66,7	10	(BEA, MPA) > (EnnB, АМЕ, TE) >  DON > (EnnA, DAS, FusX, STC)
Травяные многокомпонентные	91	18	MPA > TE > (BEA, EnnB, STC) > АМЕ > EnnA > ( T-2 , β-ZEL) > AFL B1 > AFL G1> ( DON, FB2, OTA , Т-2 triol, DAS, ZEA , FusX)

П р и м е ч а н и е: * – в скобках указаны МТ с одинаковой частотой встречаемости.

Обнаружение МТ в образцах многокомпонентных травяных чаев

Микотоксины, обнаруженные в исследованных видах чая

почти во всех видах пищевого растительного сырья и переработанной пищевой продукции. Например, на уровне ниже ПО в продуктах питания ВЕА обнаруживался в 80 %, а энниатины в 63 % образцов. В 2014 г. EFSA был проведен анализ риска в отношении этих МТ. По результатам признана возможность хронического воздействия ВЕА и энниатинов на организм человека при поступлении с пищей, в первую очередь с продуктами из зерна [9].

Несмотря на низкие уровни содержания МТ, существует потенциальный риск кумулятивных эффектов. Токсическое воздействие, возникающее в результате одновременного потребления множества микотоксинов, может проявляться как в виде аддитивного эффекта, так и в виде синергетического, в последнем случае общая токсичность может быть выше, чем сумма индивидуальных токсичностей

Формально все образцы исследованных чаев соответствовали нормируемому показателю по AFL В1, но одновременное присутствие низких доз нескольких видов МТ, прежде всего особо опасных, может нести риски для здоровья человека при длительном поступлении в организм. Полученные данные говорят о необходимости оценки риска для здоровья сочетанного загрязнения МТ таких видов пищевых продуктов, где высока вероятность контаминации плесневыми грибами разной таксономической принадлежности – это, в первую очередь, сырье для производства специализированных продуктов для детского и диетического питания и БАД к пище на основе лекарственных растений, чаи с добавками, чаи травяные, специи и др.

Исследование токсинообразования микофлорой чая в условиях in vitro. Недостаточное внимание к плесневой контаминации чая, производимого как из традиционного чайного сырья (C. sinensis), так и из других видов растительного сырья (травяные чаи), часто базируется на мнении, что риски контаминации чая и чайного сырья микотоксинами невысоки при условии соблюдения в процессе производства, транспортировки и хранения установленных параметров влажности и температуры [31] и что даже при наличии высоких уровней контаминации плесенями токсинообразование не происходит вследствие недостатка ростовых факторов и содержания полифенольных соединений, препятствующих синтезу МТ [32]. Однако результаты исследований чая из разных регионов мира подтверждают возможность накопления опасных МТ – FB, OTA, AFL, T-2, ZEA на высоких детектируемых уровнях [11]. Например, в образцах черного и зеленого чая из розничных магазинов в Италии ОТА обнаруживался в 82 %, а в 50 % случаев в количестве 7–21 мкг/кг (на фоне доминирования A. niger и A. tubingensis), что превышало уровень, установленный для других пищевых продуктов, объемы потребления которых сравнимы с чаем, в частности для кофе – 5 мкг/кг [33]. Исследования в Швейцарии показали, что черные аспергиллы были одной из наиболее распространенной групп плесеней в 22 образцах травяных чаев, а выделенные штаммы A. niger и A. awamori в условиях in vitro продуцировали фумонизины [34]. В ряде научных публикаций показано токсинообра-зование в условиях in vitro отдельными штаммами Aspergillus sp., Fusarium sp., изолированными из образцов растительного сырья, в том числе чая из лекарственных трав [34–36]. Результаты этих исследований, полученные на нескольких видах модельных сред, показывают, что виды и уровни накопления МТ грибами-продуцентами на модельных средах имеют субстратную специфичность и не всегда адекватно отражают токсинообразование в природных ареалах. В естественных условиях различные виды плесневых грибов находятся в конкурентных отношениях, а продукция экзометаболитов – микотоксинов – является «оружием» в борьбе за субстрат.

Изучение возможности образования МТ непосредственно в чайном субстрате проводили в условиях in vitro , наиболее приближенным к реальным с повышенной влажностью. В качестве единственного субстрата был зеленый чай C. sinensis , а продуцентами МТ – консорциумы микромицетов, естественным образом присутствующие в образцах чая. Для этого были выбраны предварительно проанализированные образцы травяных моно- и многокомпонентных чаев с уровнями контаминации плесенями 10³–7·10⁴ КОЕ/г, превышающими установленный норматив. С образцов сухих чаев делали смывы, которыми инокулировали агаризованную питательную среду, содержащую измельченные листья зеленого чая C. sinensis . В контрольном образце в качестве инокулята была стерильная вода. Через 10 суток инкубирования из субстрата экстрагировали МТ и проводили анализ их содержания методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме мультидетекции по приведенной выше методике.

В результате было выявлено, что МТ, которые не обнаруживались в исходных образцах сухого чая, накапливались в значительных количествах в экстрактах из питательной среды (мкг/кг питательной среды): среди них опасные МТ, нормируемые в пищевой продукции: FB 1 – 294; FB 2 – 4,8–5694; ZEA – 128; и ЭМТ: STC – 14,4; EnnB – 1,8; BEA – 1,36–9,0; MPA – 23–303; AME – 158 (табл. 8). Полученные результаты подтвердили способность токсигенных видов плесневых грибов, контаминирующих чай, к одновременному накоплению разных видов МТ и ЭМТ непосредственно в растительном субстрате из листьев C. sinensis в качестве единственного питательного компонента при наличии благоприятных условий (влажность – температура), что показывает их потенциал в загрязнении чаев микотоксинами.

Выводы. Результаты скрининга 29 МТ в образцах различных видов чая показали, что отобранные в торговой сети и предоставленные оптовыми поставщиками образцы зеленого и черного чая C. sinensis загрязнены МТ на низких (следовых) уровнях. В травяных чаях выявлен более широкий спектр МТ и ЭМТ, в том числе тех, которые регламентируются в пищевой продукции. Из них содержание 12 превышало следовые количества. Ни в одном из 77 образцов не обнаружено превышение установленного норматива AFLB1 (<5 мкг/кг).

Таблица 8

Образование МТ плесневыми контаминантами чая в модельных условиях in vitro

№ образца чая	Видовой состав жизнеспособных плесневых грибов в исходных образцах сухого чая*	Микотоксины, выявленные в питательной среде в условиях in vitro
		на уровне ˃ МОК, мкг/кг	на уровне < МОК, следы
2	Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Fusarium sp., Alternaria sp.	EnnВ-1,8	TE
3	Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Fusarium sp., Alternaria sp.,	BEA-9,0	AME
4	Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Fusarium sp., Alternaria sp.	FB1-294 ; FB2-218 ; ZEА-128	BEA
5	Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Penicillium sp., Fusarium sp., Alternaria sp.	FB2-952	STC, T-2, BEA, DAS
6	Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Alternaria sp.	STC-14,4; FB2 -4,8	β -ZEL, AME
7	Penicillium sp., Aspergillus sp., Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Epicoccus sp., Fusarium sp., Alternaria sp.	MPA-23	AFLB1, BEA, Т-2
8	Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Fusarium sp., Penicillium sp., Alternaria sp.	BEA-1,36	–
9	Penicillium sp., Aspergillus секции Nigri, Aspergillus sp., Mucor sp., Fusarium sp. Alternaria sp.	FB2-5624; MPA-303	EnnA и В, BEA
10	Penicillium sp., Aspergillus секции Nigri, Aspergillus sp., Fusarium sp.,	MPA-45	–
11	Penicillium sp., Aspergillus sp., Aspergillus секции Nigri, Mucor sp., Fusarium sp. Epicoccus sp., Alternaria sp.	AME-158	BEA
12	Aspergillus секции Nigri, Aspergillus sp., Penicillium sp., Mucor sp., Fusarium sp.	–	AFLB1 , BEA
Субстрат**	Не обнаружены	–	–

П р и м е ч а н и е: * – по данным, полученным авторами ранее [13]; ** – зеленый чай C. sinensis ; «–» – МТ не обнаружены.

Полученные данные об обнаружении микотоксинов, в том числе малоизученных эмерджент-ных, и их сочетанной контаминации в традиционных ( C. sinensis) и травяных чаях показывают, что с учетом кумулятивных эффектов, даже на низких уровнях, эти контаминанты могут представлять потенциальную опасность для здоровья человека при длительном поступлении в организм. Для оценки безопасности этого вида продукции необходим ее мониторинг и накопление массива данных о контаминации спектром микотоксинов, включая эмерджентные.

Сопоставление загрязненности чаев микотоксинами и плесневыми грибами показало, что низкие уровни плесневой контаминации не служат гарантией отсутствия микотоксинов, но с увеличением численности плесеней спектр микотоксинов расширяется.

Исследование токсиногенных свойств микофлоры чая в условиях in vitro, приближенных к естественным (где в качестве субстрата были использованы листья зеленого чая C. sinensis), подтвердило способность токсигенных видов плесневых грибов, загрязняющих чай, продуцировать одновременно разные виды МТ и ЭМТ в значительных количествах, сопоставимых с уровнями, нормируемыми в пищевой продукции растительного происхождения (мкг/кг): FB1-294, FB2-5624, ZEN-128, STC-14,4 AME-158.

Сокращенные названия: альтернариол (АОН), афлатоксины B1, В2, G1 и G2 (AFL B1, В2, G1 и G2), 3- и 15-ацетил дезоксиниваленол (3- и 15-AcDON), боверицин (BEA), дезоксиниваленол (DON), диацеток-сискирпенол (DAS), α -зеараланол (зеранол, α -ZAL), β -зеараланол (талеранол, β -ZAL), α - и β -зеараленол ( α - и β -ZEL), зеараленон (ZEN), микофеноловая кислота (MPA), метиловый эфир альтернариола (АМЕ), монилиформин (MO), неосоланиол (NeoS), ниваленол (NIV), стеригматоцистин (STC), тентоксин (TE), T-2 (Т-2-токсин), НT-2 (НТ-2-токсин), T-2-триол (Т-2-triol), фузаренон Х (4-ацетил ниваленол, FusX), фумонизины В1 и В2 (FB1 и FB2), энниатины А и В (EnnA, EnnB).

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 18-16-00077) «Эмерджентные микотоксины в пищевых продуктах растительного происхождения: разработка методов анализа, изучение контаминации, видовая характеристика микромицетов-продуцентов, разработка гигиенических нормативов».