Изыскание оптимальной питательной среды для получения анатоксинов бактерий Clostridium perfrin gens

В последние годы во многих скотоводческих хозяйствах Среднего Поволжья диагностируются анаэробная энтеротоксемия молодняка крупного рогатого скота. В отдельных хозяйствах переболевает до 45 % нарождающегося молодняка, сохранность их не превышает 80 %. Заболевание обусловлено интенсивным размножением возбудителя болезни – бактерий Clostridium perfringens (Cl. perfringens) в кишечнике и всасыванием образующихся токсинов в общий кровоток. В патогенезе анаэробной энтеротоксемии имеет значение и септический компонент. Заражение молодняка происходит в основном алиментарным путем.

Анаэробную энтеротоксемию у животных вызывают спорообразующие бактерии Cl. perfringens различных типов: А, В, С, D и Е. У телят заболевание часто бывает обусловлено серотипами А, С и D [3, 4, 5]. Исследованиями, проведенными нами в 57 неблагополучных по желудочнокишечным заболеваниям скотоводческих хозяйствах Среднего Поволжья, анаэробная энтеротоксемия установлена в 18 (31,6 %) хозяйствах [1, 5]. У новорожденных телят заболевание протекало в острой форме, наблюдалась у них геморрагическая диарея и явления общей интоксикации. У молодняка более старшего возраста отмечалось молниеносное или подострое течение болезни, не всегда проявлялся весь комплекс клинических признаков болезни. Заболевание при молниеносном течении заканчивалось летальным исходом через 2-6 часов после появления первых признаков болезни. Лечение не всегда бывает своевременным и эффективным. В этой связи актуальна разработка вакцины для специфической профилактики анаэробной энтеротоксемии молодняка крупного рогатого скота.

Известно, что качество вакцины, полученной на основе анатоксинов, зависит от титра токсина в ростовой питательной среде, который в свою очередь зависит от качества питательной среды и технологии культивирования [2, 6].

Цель настоящих исследований – изыскание оптимальной питательной среды для культивирования бактерий Cl. perfringens с целью получения анатоксинов, необходимых для изготовления ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии.

Материал и методы исследований. Исследования проводили в лаборатории бактерийных инфекций ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ. В работе использовали:

• -    производственные штаммы Cl. perfringens: № 28 – тип А, 392 – тип С, 213 - типов Д;

• -    питательные среды: МПБ, Хоттин-гера, тиогликолевая, Китта-Тароцци, ГРМ-бульон, мясо-печеночно-казеиновая;

• -    сыворотки антитоксические Кл. перфрингенс типов А, С, Д диагностические;

• -    животные - кролики массой 3,03,5 кг;

• -    оборудования и приборы: микроскоп медико-биологический Nikon type 104 c Eclipse E 200, биореактор LabFors 5, сте-

  рилизатор паровой ВК-75-01, стерилизатор воздушный автоматический ГП-320-ПЗ, бокс микробиологической безопасности БМБ-II «Ламинар-С»-1,2 (231-120), рН метр рН-150МИ, весы электронные A&D EK-6000i, термостат электрический суховоздушный ТС-1/80 СПУ, холодильник фармацевтический «ПОЗИС» ХФ-250-3.

Результаты исследований. Производственные штаммы Cl. рerfringens вначале выращивали на тиогликолевой среде, затем их пересевали на изучаемые питательные среды в количестве 5 % посевного материала к общему объему питательной среды и выдерживали при 37 оС в течение 8 часов. По истечении этого времени про- водили отбор проб питательных сред для определения в них титров токсинов Cl. рerfringens в реакции иммунодиффузии с использованием диагностических сывороток антитоксических Кл. перфрингенс типов А, С, Д. При этом наиболее интенсивный рост и образование токсинов Cl. рerf-ringens наблюдали в мясо-печеночно-казеиновой среде с аминным коэффициентом 0,7-0,8 (Таблица 1), что послужило основанием для использования этой среды для получения анатоксинов и соматических антигенов Cl. рerfringens при изготовлении ассоциированной вакцины против анаэробной энтеротоксемии и эшерихиоз-ной диареи телят.

Таблица 1 – Токсинообразование бактерий Cl. perfringens на искусственных питательных средах

Из данных таблицы 1 видно, что наиболее оптимальными питательными средами для культивирования бактерий Cl. perfringens и получения анатоксинов являются мясо-печеночно-казеиновая и тио-гликолевая питательные среды. Тиоглико-левая среда для изготовления вакцины не совсем подходит, так как в своем составе содержит агар-агар. Поэтому в дальнейшем для получения анатоксинов бактерий Cl. perfringens, необходимых для изготов- ления вакцины, использовали мясо-печеночно-казеиновую среду. С этой целью производственные штаммы Cl. perfringens № 28, 392, 213 выращивали в анаэробных условиях биореактора на мя-со-печеночно-казеиновой среде в течение 6-9 часов, при температуре 37-38 оС. После накопления в ростовой питательной среде бактерий Cl. perfringens не менее 4 млрд./см3 микробных клеток, проводили инактивацию бактериальной культуры пу- тем добавления в нее формалина до 0,7 % конечной концентрации и выдерживания при температуре 37-38 оС в течение 10 суток. По истечение этого времени, проводили проверку культуры на качество инактивации путем посева ее на мясо-печеночно-казеиновую среду. При удовлетворительном результате, в бактериальную суспензию вносили 6 % раствор гидроокиси алюминия из расчета 100 см3 на 1 л культуры и выдерживали 3 суток при периодическом перемешивании. Затем уда- ляли 50 % общего объема надосадочной жидкости, устанавливали рН 7,2-7,4.

Далее проверяли антигенные свойства полученного анатоксина на кроликах. Сорбированный на гидроокиси алюминия анатоксин вводили 5 кроликам подкожно двукратно с интервалом 14 дней в дозе 2 см3. Через 7 и 14 дней после введения анатоксина у них брали кровь и исследовали ее сыворотку на содержание специфических антителу к Cl. perfringens, результаты которых представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Антигенная активность анатоксинов Cl. perfringens, полученных на мясо- печеночно-казеиновой среде (М±m, n=5)

Из таблицы 2 видно, что сорбированные на гидроокиси алюминия бактерии и анатоксины Cl. perfringens обладают высокой антигенной активностью, индуцируют у кроликов выработку специфических антител в сыворотке крови в титрах до 13,84±0,22 log 2 .

Заключение. Изыскана оптимальная питательная среда для получения биомассы и анатоксинов Cl. perfringens – мя-со-печеночно-казеиновая среда. Установлено, что антиген, полученный из биомассы и анатоксинов производственных штаммов Cl. perfringens № 28, 392, 213, обладает высокой антигенной активностью, индуцирует у кроликов выработку специфических антител в сыворотке крови в титрах до 13,84±0,22 log 2 .