Эффект наноразмерных частиц гидроксилапатита на кроветворные прекурсоры костного мозга in vitro

Биологическое значение наноразмерных частиц рассматривается в следующих основных направлениях: 1) токсичность частиц износа имплантатов; 2) биосовместимость и специфическая активность собственно наночастиц; 3) свойства наночастиц как носителей (средств доставки) лекарственных препаратов и биологических молекул.

Активный поиск биосовместимых наноматериалов для конструирования систем целевой доставки лекарств и биологических молекул сосредоточен на липосомах и твердотельных частицах [1, 2]. Одними из первых средств доставки были апробированы фосфаты кальция и апатиты [1], в наноразмерном варианте успешно применяющиеся до сих пор [9].

Кроме того, как источник кальция фосфаты кальция интересны в плане регуляции стволовых клеток, группирующихся в костном мозге вблизи костной ткани [6]. Известна активность катионов меди и цинка [10, 11] на уровне пула стволовых и родоначальных кроветворных клеток. С другой стороны, существует проблема внутриклеточной доставки ионизированных частиц.

Ранее нами были синтезированы нанораз-мерные частицы гидроксилапатита (ГАП) с включением в структуру малых количеств калия, меди, цинка, бария, магния [7], что позволяло регулировать их биологическую активность in vitro [3].

Данная работа посвящена изучению эффектов наночастиц синтетических ГАП как потенциальных средств доставки биологически активных катионов на колониеобразующую способность клеток-предшественников грануло- и моноцитопоэза в многоклеточной системе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Механохимический синтез наноразмерного ГАП проводили, как описано нами ранее [7]. Был синтезирован гидроксилапатит стехиометрического состава Са10(РО4)6(ОН)2 и апатит Са10(Cu,Zn)0,08(PO4)6(OH)2,16 с включением сверх стехиометрии в его решетку ионов цинка и меди в количестве, соответствующем среднему значению этих катионов в составе биологического апатита. Электронная микроскопия (JEM-200CX, Япония) показала, что наряду с частицами диаметром 10-40 нанометров, в порошке присутствуют их агрегаты размером до 100 нм (рис. 1). Фазовый состав и кристалличность синтезированных нанопорошков, представленных в таблице 1, подтверждены данными рентгенофазового анализа (РФА) и инфракрасной спектроскопии (ИКС) (рис. 2, 3).

Рис. 1. Электронная микроскопия частиц механохимически синтезированного гидроксилапатита. Увеличение 75000

20   24   28   32   36   40   44   48   50

20, град.

Рис. 2. Рентгенограмма апатита с включением в решетку ионов цинка и меди сверх стехиометрии

Рис. 3. Инфракрасный спектр апатита с включением в решетку ионов цинка и меди сверх стехиометрии

Определяли рН стерильных экстрактов нанопорошков ГАП, полученных согласно требованиям ISO 10993-5 в условиях их 1-5недельного культивирования при 37 С в концентрации 0,1 мг/мл изотонического раствора хлорида натрия.

Эксперименты in vitro проводились в осеннезимний период с использованием биологического материала 5 мышей линии СВА/CaLac. Мышей умерщвляли эфирным наркозом, выделяли костный мозг бедренных костей в концентрации 0,5 106 кариоцитов/мл и культивировали в объеме клеточной взвеси 4,5 мл в течение 1 часа с нанопорошками (0,1 мг/мл культуры клеток) стехиометрического (Ca/P=1,67) ГАП, ГАПCu,Zn с введением в решетку меди и цинка. В контрольные пробирки добавляли соответствующий объем (0,5 мл) растворителя (изотонического раствора хлорида натрия).

Часть нефракционированной клеточной взвеси использовали для выявления колониеобразующей способности костного мозга. Цитотоксичность исследуемых образцов определяли в тесте с 0,4 % трипановым синим до и через 24 часа после культивирования с миелокариоцита-ми в описанных выше условиях.

Длительное (в течение 7 дней) клонирование клеток костного мозга проводили в 35-мм чашках Петри при 37 оС и 5 % СО2 в концентрации 0,75 106 жизнеспособных кариоцитов в 1,5 мл культуральной среды. Для культивирования клеток применяли питательную среду (280 мг/л L-глутамина (Sigma), 40 мг/л гентамицина сульфат, 15 % эмбриональной телячьей сыворотки (ICN), 85 % среды 199 (НПО Вектор), позволяющую определять спонтанную (без факторов роста) колониеобразующую активность костного мозга. Контролем роста служила культура интактных миелокариоцитов после добавления изотонического раствора хлорида натрия.

Через 7 дней подсчитывали число колониеобразующих единиц (КОЕ) клонов родоначальной клетки. Под гранулоцитарными прекурсорами (КОЕ-Г) подразумевали колонии из 50 и более ядросодержащих элементов, имеющих морфологию гранулоцитов при окраске азуром II-эозином. Родоначальные клетки моноцитов (КОЕ-М) формировали клоны, включающие 30-50 адгезирующих мононуклеаров, морфологически идентифицируемых при обычной окраске как моноциты/макрофаги. Колонии фотографировали, по площади определяли число клеточных делений по методике, описанной ранее [8].

Статистическую обработку результатов проводили согласно непараметрическому U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (РU) и Т-критерию Вилкоксона (PT).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эксперименты показали неоднозначные результаты (табл. 1). Наночастицы ГАП с катионной модификацией сверх стехиометрии (ГАП Cu,Zn ) стимулировали в культуре in vitro выход родоначальных клеток грануло- и моноцитопоэза. Цитологический анализ показал, что число КОЕ-Г, вступающих в деление, возрастало по сравнению с контрольной культурой клеток до 272-282 %. Более того, после воздействия в деление вступали более молодые (примитивные) клетки-предшественники кроветворения. Так, если в контрольной культуре КОЕ способны выполнять не более 6-7 клеточных делений, то после взаимодействия с наночастицами ГАП_Cu,Zn количество клеток в индивидуальных колониях соответствовало 8-10 митозам (рис. 4). Согласно кинетическим параметрам кроветворных клеток [4], речь может идти о грануломоноцитарных прекурсорах (КОЕ-ГМ), дифференцирующихся в пролиферирующие унипотентные предшественники.

Таблица 1 Содержание колониеобразующих единиц моноцитов (КОЕ-М) и гранулоцитов (КОЕ-Г) в жидкой культуре миелокариоцитов мыши после 7 суток культивирования с исследуемыми образцами, Х

Исследуемый образец, n=3	Число колоний, %
	КОЕ-М	КОЕ-Г
Контроль	100
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 стехиометрический	231		183
Ca 10 (Cu,Zn) 0,08 (PO 4 ) 6 (OH) 2,16	272* Р=0,02		282* Р=0,036

Примечание: n – число исследованных образцов; Р – статистически значимые различия с контролем согласно U-критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.

Рис. 4. Колония кроветворных клеток, выросшая на 7-е сутки культивирования в жидкой питательной среде в присутствие наночастиц гидроксилапатита. Скопления наночастиц в пределах колонии визуализированы посредством контрастирования снимка в оттенках серого цвета. Увеличение 150

Стимулирующее влияние наночастиц ГАПCu,Zn на родоначальные клетки теоретически может быть прямым и/или опосредованным через продукты их растворения. Сам ГАП, кальций и другие катионы могут регулировать активность клеток, в том числе на уровне генов [6, 10, 12].

Вместе с тем, синтетический стехиометрический ГАП не обладал статистически значимым колониестимулирующим влиянием (табл. 1). При этом отсутствие биологического эффекта не было связано с цитотоксичностью изучаемых образцов (табл. 2). Известна малая растворимость стехиометрического ГАП в области физиологических значений рН=7,2 [5]. В то же время, нестехиометрические апатиты обладают повышенной резорбируемостью [5], способствующей изменению физико-химических свойств биологических жидкостей. Действительно, в динамике длительного (5-недельного) растворения исследуемых наночастиц, ГАПCu,Zn, но не стехиометрический ГАП, вызывал стабильное (PT<0,05) превышение значений рН по сравнению с растворителем (рис. 5).

Таблица 2

Показатели выживаемости миелокариоцитов (%) в 24-часовых клеточных культурах, Х

Исследуемый образец, n=3	Число жизнеспособных клеток костного мозга
Контроль	85,39 n1=9
Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 стехиометрический	77,37 n1=15
Ca 10 (Cu,Zn) 0,08 (PO 4 ) 6 (OH) 2,16	81,30 n 1 =10

Примечание: n 1 – число определений.

■ гидроксилапатит с включением в молекулу атомов цинка и меди □ стехиометрический гидроксилапатит

Рис. 5. Динамика изменений рН экстрактов при длительном растворении различных образцов нанораз-мерного синтетического гидроксилапатита

В связи с установленной ранее биологической активностью экстрактов замещенных ГАП [3], можно считать, что один из механизмов повышения колониеобразующей способности унипотентных родоначальных клеток костного мозга связан с влиянием продуктов растворения наночастиц ГАПCu,Zn.

В настоящее время идет разработка критериев для отбора наноразмерных биосовместимых материалов в качестве носителей лекарственных и биологических молекул. Биологические молекулы, включая белки, легко адсорбируются на поверхности ГАП [9, 12]. Однако не всегда применение таких комплексов сопровождается достижением желаемого результата [12].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, один из механизмов позитивной реакции родоначальных кроветворных клеток костного мозга на добавление наночастиц ГАПCu,Zn in vitro может быть связан с влиянием продуктов их растворения. Манипуляции на атомарном и молекулярном уровнях (10 10-10 12м) способствуют созданию неорганических, компо- зитных, биоактивных наноматериалов, что позволяет решить многие проблемы (стерилизация, активность гибридных материалов, дороговизна и т.д.), тормозящие развитие современной биотехнологии.

Работа выполнена в рамках проекта Европейской комиссии NMP3-CT-2003-504937.