Эффективная схема индукции полиовуляции для трансплантации эмбрионов у коз

Технология трансплантации эмбрионов складывается из нескольких элементов, причем каждый представляет собой самостоятельную операцию. Первая из них — это подбор доноров, у которых стимулируется множественная овуляция. Теоретические принципы индукции полиовуляции, разработанные еще М.М. Завадовским в 1935 году с целью повышения плодовитости овец, получили продолжение в работах отечественных и зарубежных ученых (1).

В первых экспериментах для стимуляции роста фолликулов и контроля за овуляцией использовались гонадотропные препараты, полученные из мочи беременных женщин (хорионический гонадотропин человека — ХГЧ, пролан) (2, 3). Однако другие исследователи выявили отрицательные эффекты ХГЧ: он снижает оплодотворяемость, вызывает преждевременную регрессию желтых тел, повышает эмбриональную смертность, приводит к разновременному приходу животных в охоту и удлинению этого периода (4). Т. Sugie с соавт. (5) в опытах на овцах с целью индукции суперовуляции обрабатывал животных гонадотропином сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и ХГЧ в дозе 800 ед. У 93 % из 44 обработанных овец было обнаружено от 1 до 36 овуляций (в среднем 7,9 на одного донора). От 31 овцы получили 132 яйцеклетки, или 4,2 на одного донора, 101 из которых были оплодотворенными, однако 50 % клеток оказались непригодными для пересадки (5).

И.Я. Шихов (6) для суперовуляции на 12-е сут полового цикла вводил фоллигон в дозе 1000 И.Е. с последующей обработкой простагландином Ф2-альфа (эстрофан) в дозе 250 мкг. Число овуляций в среднем на

Исследования выполнены в рамках Международной программы «Разработка технологий и организация опытного производства высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств нового поколения и биологически полноценного детского питания на основе лактоферрина человека, получаемого из молока трансгенных животных, на 2009-2013 г.г.» («БелРосТрансген-2», Россия-Белоруссия»).

одного донора составило 10,2 (с вариабельностью от 0 до 18), на одного положительного донора было получено 6,9 яйцеклетки, из них полноценных 4,7 (6). J.P. Ryan, основываясь на собственных экспериментах, утверждает, что повышение числа нормальных эмбрионов обеспечивается совместным применением ГСЖК и фолликулостимулирующего гормона ФСГ-п (7).

При индукции полиовуляции главной проблемой считается вариабельность ответа яичника на обработку (8-11). Различия в реакции яичников на эстрогенные гормоны объясняют изменением эндогенного гормонального фона, который непосредственно влияет на процесс оплодотворения и развитие эмбриона (12, 13). Также было выяснено, что наличие выраженного желтого тела на момент инъекции гонадотропина гарантирует хорошую реакцию суперовуляции. Наличие в яичнике фолликула одновременно с желтым телом снижает результат гормональной обработки. В этих случаях в отношении степени полиовуляции результат часто оказывается отрицательным (14).

Современные исследования по индукции полиовуляции у коз также подтверждают, что индивидуальная изменчивость в реакции яичников отмечается даже при применении стандартных схем и доз гонадотропных препаратов. Более того, ни одна из проверенных и рекомендованных схем гормональной обработки не обеспечивает устойчивого ответа яичников (15, 16). Следовательно, совершенствование этой методики для получения полиовуляции со стабильно высоким процентом гормональных ответов у доноров и достаточным числом полноценных, способных к имплантации эмбрионов остается задачей, которая все еще требует решения.

Нашей целью была разработка оптимальной схемы гормональной обработки коз-доноров для обеспечения контролируемой полиовуляции.

Методика . Исследования осуществляли в условиях опытной станции. В экспериментальные группы отбирали коз зааненской породы 2-3-й лактации. Опыты проводили как в эстральный, так и в анэстральный сезон. Общее число животных составило 68 гол. Для стимуляции полиовуляции применяли препараты производства компании «Intervet» (Нидерланды).

Для пролонгации/имитации лютеиновой фазы и синхронизации половых циклов использовали ушные импланты Крестар (действующее вещество — синтетический аналог прогестерона норгестамет). Имплант вводили в области латеральной поверхности уха в месте рыхлого соединения кожи с хрящом, где отсутствуют крупные кровеносные сосуды. Для этого имплантатором с вложенным в него имплантом делали прокол кожи в зоне ушного кармана и осторожно продвигали иглу параллельно гребню ушной раковины у ее каудального края. После продвижения на 2-4 см иглу немного отводили назад и выталкивали под кожу имплант мандреном. Для прерывания лютеиновой фазы и стимуляции развития фолликулов применяли гонадотропные препараты фоллигон и оваген. Фол-лигон представляет собой ГСЖК, оваген содержит овечий питуитарный ФСГ (NIADDK-oFSG-17). Для индукции одновременных овуляций созревших фолликулов использовали препарат хорулон (действующее вещество — ХГЧ), обладает активностью лютеинизирующего гормона (ЛГ).

Сроки наступления и длительность половой охоты определяли с помощью козлов-пробников. Выборку коз в охоте начинали спустя 12 ч после извлечения имплантов и повторяли каждые 2 ч до окончания периода охоты. Коз в охоте осеменяли интрацервикально свежеполученной неразбавленной спермой согласно инструкции (17).

Количество половых и гонадотропных гормонов в крови подопытных животных в течение эксперимента контролировали, регистрируя периодически концентрацию ЛГ, ФСГ, прогестерона и эстрадиола методом ИФА. Схему экспериментов приводили в соответствие с полученными данными о гормональном фоне коз.

Наличие и качество полиовуляции определяли по результатам осмотра яичников, оценки возраста и полноценности полученных эмбрионов с применением лапароскопии либо лапаротомии. К пригодным для трансплантации относили оплодотворенные ооциты, а также 2- и 4-блас-томерные эмбрионы без нарушений в строении и целостности оболочки, развивающиеся при инкубировании.

При разработке схемы варьировали дозы, сроки и кратность введения препаратов.

Полученные результаты обрабатывали статистически в программе BioStat.

Результаты . Использованный прием синхронизации половых циклов заменяет трудоемкую процедуру выявления особей в охоте с последующим отслеживанием ее длительности и расчета средней индивидуальной продолжительности по каждому животному, как это принято при индукции суперовуляции в скотоводстве. Для синхронизации охоты группу коз фронтально (без учета полового цикла) обрабатывали прогестагеном. При этом у животных, которые находились в фолликулярной фазе, имитировали лютеиновую фазу (у особей, уже находящихся в лютеиновой фазе, она пролонгировалась). Последующее удаление импланта, прерывающее действие прогестагена, обеспечивало получение синхронизированных половых циклов на известной стадии у всех животных группы.

При определении оптимального срока аппликации имплантов (8, 9, 10 и 12 сут, доза — 1,5 мг по действующему веществу, д.в.) выяснили, что ее продолжительность не имела значения. Особи, которым имплант вводили на 8 и 12 сут (крайние значения), в равной степени синхронно приходили в охоту, и при соответствующей гормональной обработке эффективность полиовуляции у них достоверно не различалась. Диапазон концентраций прогестерона у коз, находящихся на разных стадиях полового цикла, начинал выравниваться уже к 5-м сут обработки (рис. 1), и к 78-м сут синхронизация половых циклов наблюдалась во всех сравниваемых группах.

Срок обработки, сут

Рис. 1. Динамика концентрации прогестерона при синхронизации половых циклов у коз зааненской породы при применении имплантов Крестар: 1-8 — особи, исходно находящиеся на разных стадиях полового цикла.

Следовательно, время аппликации ушных имплантов можно уменьшить с 12 до 8 сут, что позволяет существенно сократить срок всей гормональной обработки (на 4 сут, или на 33,3 %).

Далее мы сравнили эффект введения животным ова-гена по двум схемам. В одной группе козы получали препарат дважды в сутки с интервалом 12 ч в течение 4 сут в равных дозах (по 0,8 мл/гол. утром и вечером), во второй — также с интервалом 12 ч в течение 4 сут, но в возрастаю - щей дозировке (по 0,6; по 0,8; по 0,8 и по 1 мл/гол. утром и вечером). Общая доза овагена в обеих группах составила 6,4 мл, или 5,6 мг д.в. на одно животное. Кроме того, всем особям из обеих групп за 60 ч до извлечения импланта вводили по 500 ед. фоллигона и в начале периода половой охоты по 150 ед. хорулона.

1. Результаты индукции полиовуляции у коз зааненской породы при применении схемы с постоянной (I группа) и возрастающей (II группа) дозировкой овагена ( M ± m )
Показатель                 |	I группа	|       II группа
Всего обработано, гол.	7	9
Реагировало полиовуляцией, гол/%	7/100	8/100
Реакция полиовуляции, желтых тел/гол.	10,67±2,10	12,17±3,44
Положительных по извлечению доноров, гол/%	9/100,0	8/100,0
Извлечено эмбрионов, шт/гол.	7,35±1,17	8,02±2,22
В том числе:
пригодных для трансплантации	3,26±0,33	3,42±1,15
непригодных для трансплантации	4,09±0,56	4,58±1,13
Из них неоплодотворенные яйцеклетки, шт.	3,64±0,55	3,72±1,05
Выход пригодных эмбрионов, %	44,4	42,6

При обеих описанных схемах введения овагена (табл. 1) практически 100 % особей пришли в охоту при показателе полиовуляции 10,7012,17 желтого тела (ж.т.) на животное (р > 0,05). Однако в обоих вариантах высокий процент неоплодотворенных клеток и низкий выход полноценных эмбрионов свидетельствовали о несинхронности овуляций. На яичниках отмечались петехии, имелись желтые тела разного возраста, созревшие, но не лопнувшие фолликулы.

На основании обследования яичников и анализа полученных результатов мы модифицировали описанную схему, увеличив количество хорулона до 300 ед., и сравнили эффект в двух группах животных, из которых в первой особей обрабатывали по предыдущей схеме, во второй — с применением удвоенного количества хорулона (табл. 2). Увеличение дозы хорулона значительно улучшило результаты обработки. Реакция полиовуляции и, главное, выход пригодных для трансплантации эмбрионов достоверно возросли и составили соответственно 12,6 ж.т./гол. и 68,7 %.

2. Результаты индукции полиовуляции у коз зааненской породы при исходной (I группа) и повышенной (II группа) дозе хорулона ( M ± m )

Показатель                 |	I группа	|       II группа
Всего обработано, гол.	3	6
Реагировало полиовуляцией, гол/%	3/100	6/100
Реакция полиовуляции, желтых тел/гол.	10,60±2,80	14,32±1,54
Положительных по извлечению доноров, гол/%	3/100,0	6/100,0
Извлечено эмбрионов, шт/гол.	8,33±2,03	12,60±1,25
В том числе:
пригодных для трансплантации	3,85±1,14	8,65±0,49
непригодных для трансплантации	4,48±0,90	3,95±0,19
Из них неоплодотворенные яйцеклетки, шт.	3,00±1,11	2,32±0,25
Выход пригодных эмбрионов, %	46,1	68,7

При индукции полиовуляции с применением экзогенных гормональных препаратов важно контролировать концентрацию собственных гормонов животного. Оценив динамику показателей для ЛГ, ФСГ, прогестерона и эстрадиола на фоне гормональной обработки (рис. 2), мы обнаружили, что их значения по сывороточным гормонам у коз при индукции полиовуляции были ниже, чем при естественном половом цикле. Особенно это проявилось в отношении ФСГ, что вступает в некоторое противоречие с высокой активностью фолликулогенеза у обработанных животных. Однако в целом динамика концентрации половых и гонадотропных гормонов соответствовала последовательности введения экзогенных препара- тов и изменениям в организме, обусловленным индукцией искусственного эстрального цикла.

В связи с достаточно низким уровнем ЛГ в сыворотке крови у обрабатываемых коз доза хорулона была еще раз увеличена (до 500 ед.), а время введения препарата изменили (вместо начала охоты его стали вводить через 3 ч после ее начала), причем для ускорения поступления всей дозы к клеткам-мишеням внутримышечное введение заменили на внутривенное. Кроме того, так как в 90 % случаев охота у доноров наступала в промежутке от 12 до 20 ч после извлечения импланта и к последней инъекции овагена животным уже был введен хорулон (то есть необходимость в заключительной инъекции овагена отпадала), однократную дозу препарата увеличили с 0,8 до 1,0 мл, а число введений сократили с 8 до 7. Для

А

Б

Рис. 2. Динамика концентрации половых (А; а — эстрадиол, б — прогестерон) и гонадотропных гормонов (Б; в — ЛГ, г — ФСГ) в сыворотке крови коз зааненской породы при применении разработанной схемы индукции полиовуляции: 1 — 0-е сут обработки (введение импланта), 2 — 2-е сут, 3 — 4-е сут, 4 — 6-е сут, 5 — оваген + фоллигон, 6 — извлечение импланта, 7 — за 3 ч до охоты, 8 — начало охоты, 9 — 3 ч от начала охоты, 10 — 5 ч от начала охоты, 11 — 7 ч от начала охоты, 12 — 10 ч от начала охоты, 13 — конец охоты.

одновременного оплодотворения вышедших в яйцевод ооцитов вместо 3-4-кратного осеменения доноров с начала охоты, использовали только 2-кратное — через 6 и 10 ч после ее начала.

По описанной схеме были обработаны доноры в четырех экспериментах (в эстральный и анэст-ральный сезоны года). Проведенные нами опыты показали достаточно однородные результаты (табл. 3).

Все козы пришли в охоту. Состояние половой охоты характеризовалось наличием и полноценным проявлением всех ее феноменов (положительная локомоторная реакция на самца, течка, рефлекс неподвижности).

Продолжительность периода охоты в среднем составила 22-28 ч, время от извлечения импланта до начала охоты — 14,5-19 ч. При этом

отмечали определенную закономерность: чем меньше времени от извлечения импланта до начала охоты, тем больше ее продолжительность.

Реакция полиовуляции составила 15,52-17,5 ж.т./гол., при этом доля клеток, пригодных для трансплантации, была очень высока и составляла 74,3-90,4 % от всех извлеченных.

При этом не наблюдалось перестимуляции яичников, не было кист, созревших, но не лопнувших фолликулов. Размеры яичников составляли

2,80±0,26х2,12±0,20 см при диаметре желтых тел 4-6 мм (рис. 3).

• 3.    Результаты получения пригодных для трансплантации эмбрионов у коз зааненской породы при применении разработанной схемы индукции полиовуляции ( M ± m )

  Число доноров

  Время от извлечения импланта до начала охоты, ч

  Продолжительность охоты, ч

  Реакция полиовуляции, число желтых тел

  Вымыто клеток, в среднем на 1 гол.

  Из них пригодных для трансплантации, шт/%

		I	опыт
7	18,70±1,34	22,75±1,73 II	17,34±1,55 опыт	12,33±1,26	11,34±1,61/83,3
5	17,50±1,81	21,92±2,49 III	15,52±1,25 опыт	12,79±1,35	9,50±0,65/74,3
8	16,60±1,61	23,58±2,17 IV	17,50±2,01 опыт	12,50±1,99	10,64±1,89/84,0
6	14,50±0,81	27,83±2,69	16,00±2,35	13,83±2,74	13,00±3,09/90,4

Примечание. Опыты проводились в разные годы на разном поголовье в эстральный и анэстральный сезон.

Рис 3. Яичники с желтыми телами при индукции полиовуляции у коз зааненской породы.

Таким образом, нами разработана схема индукции полиовуляции у коз. Она предусматривает введение иплан-тов Крестар на 8 сут; 1-кратную инъекцию 500 ед. фол-лигона и дробные инъекции 7 мл овагена с интервалом 12 ч при 1-кратной дозе 1 мл (начало инъекций — за 60 ч до извлечения имплантов); введение 500 ед. хорулона в момент фиксации половой охоты. Предложенная схема дала хорошие результаты полиовуляции с высокой степенью синхронизации овуляций, о чем свидетельствует высокий процент полученных одновозрастных клеток, пригодных для трансплантации.