Эффективность использования бусульфана для элиминации примордиальных зародышевых клеток в гонадах у эмбрионов кур

Использование примордиальных зародышевых клеток для получения генетически модифицированной и химерной сельскохозяйственной птицы - одно из перспективных направлений биотехнологии, которое рассматривается как альтернатива традиционным методам селекции и модификации генома. Получение трансгенных и химерных особей с использованием этой технологии предусматривает введение донорских примордиальных зародышевых клеток в дорсальную аорту эмбрионов-реципиентов в период миграции из крови в гонады. В случае колонизации донорскими зародышевыми клетками гонад эмбрионов-реципиентов возможна их дальнейшая дифференцировка до зрелых мужских и женских половых клеток. Один из основных факторов, определяющих эффективность проводимых манипуляций, - результативность элиминации собственных примордиальных зародышевых клеток у эмбрионов-реципиентов. В этой связи остается актуальной разработка приемов по удалению такого типа клеток. Целью наших исследований стала оптимизация методических подходов по элиминации примордиальных зародышевых клеток в гонадах у эмбрионов кур породы Первомайская. В качестве алкилирующего агента использовали бусульфан в дозах 10, 40, 70, 100, 150, 200 и 250 мкг/эмбрион. Для разведения бусульфана применяли диметилсульфоксид (ДМСО), а также его сочетание со средой DМЕМ в различных соотношениях. Введение бусульфана в эмбрионы осуществляли двумя способами: через прокол в скорлупе в тупом конце яйца до закладки яиц на инкубацию и посредством нанесения раствора препарата на зародышевый диск через окно в скорлупе в тупом конце яйца на 24-й ч инкубации. Эффективность элиминации примордиальных зародышевых клеток в гонадах оценивали на 7-е сут инкубации на основании гистологических исследований с использованием иммуногистохимич на экспрессию гена SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1). Установлено, что результативность элиминации примордиальных зародышевых клеток определяется способом подготовки и введения бусульфана в эмбрионы, а также дозой препарата. Показано снижение негативного действия на развитие эмбрионов кур ДМСО, используемого для разведения бусульфана, при включении в состав раствора препарата среды DМЕМ в концентрации 10 %. Высокая эффективность элиминации примордиальных зародышевых клеток установлена при использовании бусульфана в концентрации 100 мкг/эмбрион: снижение числа зародышевых клеток в гонадах достигало 92 % по сравнению с контролем. Использование бусульфана в большей концентрации приводило к повышению эмбриональной смертности. При этом более высокую результативность элиминации примордиальных зародышевых клеток отмечали при введении бусульфана на 24-й час инкубации эмбрионов: количество зародышевых клеток в гонадах у 7-суточных эмбрионов кур было на 12,5 % меньше по сравнению с аналогичным показателем, установленным при инъекции препарата перед началом инкубации.