Эффективность использования комбинаций сахаридов в средах для криоконсервации спермы петухов

Различные комбинации сахаридов могут обеспечить эффективную защиту семени во время цикла замораживания/оттаивания. До настоящего времени дисахарид мальтоза не использовался в качестве компонента среды для криоконсервации семени петухов. Поскольку мальтоза не участвует в углеводном обмене сперматозоидов, есть предположение о ее роли в укреплении структуры гликокаликса. В представленной работе впервые доказана эффективность использования мальтозы в сочетании с фруктозой в составе разбавителя для повышения оплодотворяющей способности заморожено-оттаянного семени петухов. Целью работы было определение оптимальной концентрации мальтозы в составе разбавителя для замораживания семени петухов в возрасте 44-50 нед и установление сроков сохранения функциональной полноценности заморожено-оттаянного семени в половых путях курицы. Эксперимент проводился в ЦКП «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» (ВНИИГРЖ) на курах ( Gallus gallus L.) породы русская белая (♂ n = 10, ♀ n = 30) в возрасте 44-50 нед. Сперму получали методом абдоминального массажа. Оценивали три варианта сред для криоконсервации семени с различным соотношением сахаридов: Mal-10 (фруктоза 0,72 %, мальтоза 0,166 %), Mal-20 (фруктоза 0,64 %, мальтоза 0,326 %) и ЛКС-контроль (Ленинградская криозащитная среда) (фруктоза 0,8 %, мальтоза 0 %). Разбавленные образцы семени охлаждали с 18 до 5 °C в течение 40 мин. Затем к каждому образцу добавляли диметилацетамид до конечной концентрации 6 %. Образцы инкубировали при 5 °C в течение 1 мин. Гранулы замораживали, накапывая семя в жидкий азот. Замороженное семя хранили в жидком азоте в течение 30 сут. Гранулы размораживали по fast-протоколу при 60 °С. Двигательную активность заморожено-оттаянных сперматозоидов оценивали в каждом экстендере с помощью визуализирующей системы CASA (сomputer-assisted sperm analysis). Для искусственного осеменения отобрали виргинных кур в возрасте 46-50 нед ( n = 30, по n = 10 в каждой опытной группе). Кур осеменяли интравагинально разовыми суточными дозами 0,04-0,07 мл заморожено-оттаянного семени: в течение первых 2 сут по одному осеменению, затем одно осеменение каждые 2 сут. Яйца для инкубации собирали ежедневно в течение 9 сут, начиная со следующего дня после первого осеменения. Яйца ( n = 239) инкубировали 6 сут для оценки фертильности. Яйца, собранные в каждой экспериментальной группе на 5-е, 10-е и 15-е сут после последнего осеменения, разбивали и оценивали оплодотворенность по наличию бластодиска. Динамику функционального состояния заморожено-оттаянных сперматозоидов в половых путях кур определяли на 5-е, 10-е и 15-е сут от последнего осеменения. В вителлиновой мембране подсчитывали отверстия - точки взаимодействия со сперматозоидами. Было обнаружено повышение общей доли оплодотворенных яиц при использовании заморожено-оттаянного семени в группах Mal-10 (92,6 %) и Mal-20 (86,3 %) по сравнению с группой ЛКС-контроль (74,7 %), а также увеличение продолжительности функциональной полноценности сперматозоидов в половых путях кур в течение 5 сут. По прогрессивной подвижности сперматозоидов (целостности кинетического аппарата) группы не различались, при этом функциональная полноценность, оцененная по числу взаимодействий с вителлиновой мембраной, существенно разнилась. Она была значительно выше при использовании экспериментальных сред Mal-10 (67,0 шт/см2) и Mal-20 (110,7 шт/см2) по сравнению с контролем (40,1 шт/см2). Наилучшие показатели фертильности сперматозоидов отмечали в группе Mal-20: даже на 15-е сут после последнего осеменения оплодотворяющая способность заморожено-оттаянного семени составляла 20 %. Согласно составленному уравнению регрессии, для приемлемой оплодотворенности яиц (не менее 80 %) достаточна такая функциональная полноценность заморожено-оттаянных сперматозоидов, при которой число точек взаимодействия с вителлиновой мембраной желтка составляет не менее 60 шт/см2. Это было достигнуто при использовании экспериментального разбавителя с 0,326 г мальтозы на 100 мл. Полученные результаты открывают перспективы использования криоконсервированного семени птицы как для сохранения генофонда, так и в селекционных программах.