Эффективность комбинированного ферментативного гидролиза для получения высокобелкового гидролизата из гороха

Ряд исследований показали, что растительные белки эффективны для снижения веса и его поддержания на заданному уровне [3, 4]. Данный фактор обуславливается низкой энергетической ценностью растительных продуктов и повышенным чувством насыщения после потребления. Преимущества включения данных продуктов в рацион, также обуславливаются снижением риска развития диабета, поддержкой здоровья при ишемической болезни и снижением общего артериального давления [2–4].

Ферментативные методы и использование солей кальция, могут существенно влиять на структуру и свойства белков, что позволяет улучшать их технологические качества [5, 6].

Изучение воздействия протеаз и солей кальция (в частности, лактата кальция) на растительные белки является ключевым для разработки новых подходов к их модификации и применения. В ранее рассмотренных работах было показано, что протеазы могут эффективно расщеплять белковые молекулы, изменяя их функциональные характеристики, например, улучшая пенообразующие свойства [2, 7, 8]. В то же время ряд исследований указывает о положительном влиянии солей кальция на коагуляцию и осаждение белков в растительных экстрактах [10, 11].

В исследовании представлены результаты исследований, направленные на изучение влияния ферментных препаратов – протеазы, амилазы, целлюлазы и вспомогательного компонента – лактата кальция на выделение белка из гороха и подсолнечного шрота в результате ферментативного гидролиза. Применение данного ферментного комплекса (протеаза + амилаза + целюлаза) в среде, активированной лактатом кальция, позволяет проводить многостадийный гидролиз сырья с высокой эффективностью. Это комплексное решение направлено на максимальное извлечение и модификацию целевых белковых компонентов при одновременном удалении основных балластных веществ. В ходе исследований выдвигаются гипотезы о том, что:

─ протеаза, оказывает влияние на структуру белка и его растворимость, что должно отразиться на массе сухого остатка. Предполагается, что протеаза будет способствовать расщеплению белковых молекул, что может привести к уменьшению массы сухого остатка по сравнению с контрольным образцом или с образцами, где протеаза не применялась;

─ лактат кальция, оказывает влияние на коагуляцию белков, что может оказать влияние на массу сухого остатка. Так, лактат кальция может способствовать образованию более плотного осадка, что позволит увеличить массу сухого остатка по сравнению с образцами, где лактат кальция не применялся;

─ комбинированное воздействие протеазы и лактата кальция может привести к более выраженным изменениям, нежели при использовании этих добавок по отдельности. Ожидается, что комбинированное воздействие может привести к изменению как массы, так и структуры сухого остатка, а также к изменению свойств жидкой фракции;

─ амилаза – способна оказать влияние на разрушение основного полисахарида в зернах гороха – крахмал. Использование данного фермента в общей системе гидролиза, позволит существенно снизить содержание углеводов, расщепляя их до более простых сахаров – мальтозу и глюкозу. Изменение углеводного состава позволит достичь наиболее чистый конечный продукт, обладающий повышенным содержания белка;

─ целлюлаза, позволяет направленно разрушать основной углеводный компонент подсолнечного шрота – клетчатку, состоящая в значительной степени из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Снижение углеводов в составе подсолнечного шрота в свою очередь позволит повысить количество высвобождаемого белка и получения наиболее чистого конечного продукта.

Стоит отметить, что данные компоненты относятся к категории безопасных и экологичных добавок, разрешённых для использования в пищевой промышленности [9, 10]. Их химическая природа определяет разные, однако в общей структуре, взаимодополняющие механизмы действия в технологическом процессе выделения растительного белка из первичного сырья. «Протозим Н» действует как биологический катализатор, модифицируя молекулярную структуру белков, в то время как амилаза, являясь ферментом, содержащимся в ЖКТ и целлюлаза, продуцируемая из грибов, позволяет существенно снизить углеводную составляющую продукта, а лактат кальция функционирует как физико-химический модификатор [11, 12].

Добавление протеазы в процессе получения гидролизата белка из зерен гороха оказывает комплексное воздействие на процесс выделения, существенно влияя на конечный общий выход продукта. Так, ферментативный гидролиз с применением протеазы «Протозим Н» способствует [12]:

─ разрушению сложной белковой матрицы зерен гороха, расщепляя глобулярные белки (легумин и вицилин) на более мелкие пептидные фрагменты. Данное разрушение приводит к значительному повышению растворимости белковых компонентов в водной среде, что облегчает их переход в экстракт при стандартных условиях экстракции (рН 7–8, температура 50–55 °C);

─ снижению общей молекулярной массы белков, что минимизирует их агрегацию и улучшает фильтруемость раствора. В результате доля белка, остающегося в нерастворимом осадке, сокращается, а общий выход увеличивается на 15–25% по сравнению с методами безферментативной экстракции;

─ способствует разрушению антипита-тельных соединений (ингибиторы трипсина), способные в нативном состоянии препятствовать полноценной экстракции белка.

Использование амилазы оказывает существенное влияние на процесс получения гидролизата белка гороха, являясь косвенным, но при этом крайне важным компонентом для повышения эффективности и качества конечного продукта. Таким образом, внесение амилазы в общей методике получения гидролизата белка гороха позволяет достигнуть:

Расщепление крахмала, значительно содержащегося в зернах гороха (40–60%), до мальтозы и глюкозы, что в свою очередь способствует резкому снижению вязкости раствора, что упрощает дальнейшую экстракцию белка и повышению его концентрации в конечном продукте;

Улучшение доступа протезы к субстрату, благодаря снижению вязкости, создаваемой крахмалом, «экранирующий» необходимые белковые молекулы и снижающий возможность их связывания с протеазами;

Стандартизации процесса, благодаря сниженному содержанию крахмала, что позволяет легче контролировать и стандартизировать условия проведения гидролиза (рН, температура, концентрация фермента);

Улучшения органолептических показателей, благодаря образованию сахаров, снижающих горечь, а также не позволяющих первоначальным молекулам крахмала взаимодействовать с белками / пептидами, способных формировать нежелательные оттенки вкуса.

Внесение лактата кальция в общем методе получения гидролизата белка гороха, оказывается ряд ключевых воздействий на технологический процесс и качество конечного продукта. Так, добавление лактата кальция в общей системе получения гидролизата белка, данный компонент выполняет функцию:

Эффективного коагулянта, способствуя осаждению белковых молекул в их изоэлектрической точке (рН 4,5–5,5). Данный процесс происходит благодаря взаимодействию ионов кальция с отрицательно заряженными карбоксильными группами (-COOH) белковых молекул, что приводит к снижению их растворимости и образованию плотного осадка;

Повышения эффективности выделения белка, поскольку выход продукта увеличивается на 15–20% по сравнению с методами, не использующими коагулянты. При этом образуется осадок с улучшенными структурными характеристиками, что облегчает его последующее отделение центрифугированием или фильтрацией;

Снижение первоначального растительного вкуса в полученном гидролизате белка без формирования дополнительного привкуса, в сравнении с другими солями кальция (например, хлорида кальция);

Способствование стабилизации белковой структуры, благодаря улучшению функциональные свойства как: водоудерживающая способность и гелеобразование [11, 12].

Материалы и методы

Объектом исследований были гидролизаты белка гороха – ГБП 1, ГБП 2, ГБП 3. Сырьем для получения белковых гидролизатов является сухой цельный горох сортов «Самариус» (Свердловская область, урожая 2024 г.). Общее содержание белка в таком горохе 26–28%, отличается высоким содержанием незаменимых аминокислот, включая лизин 1,70–1,85 г/100 г и метионин 0,27–0,32 г/100 г.

Белковые гидроизоляты были получены при различных режимах ферментативного гидролиза по следующей методике: очищенный от примесей и промытый горох измельчали до размера частиц не более 300 мкм после чего диспергировали в воде в соотношении 1:10 для получения основной суспензии.

Гидролиз белка проводили параллельно тремя методами с целью определения наиболее эффективного из них:

─ ГБП 1 – водную суспензию выдерживали в течение 2 часов при 25 °С, после чего центрифугировали при 10000× g, 5 мин, 20° и фильтровали с последующей сушкой сухого остатка;

─ ГБП 2 – водную суспензию доводили раствором 1М NаОН до рН 8,0, вносили фосфатный буфер и нагревали до t 50–55 °C, после чего вносили 0,5% лактата кальция от массы суспензии и 1,5% протеазы от массы измельченного гороха. Полученную суспензию выдерживали в течение 1,5 часов, при постоянной t, после чего центрифугировали при 10000× g, 5 мин при 20° и фильтровали т с последующей сушкой сухого остатка;

─ ГБП3 – водную суспензию доводили раствором 10% лимонной к-ты до рН 4,2–5,6, после чего нагревали до 50–55 °C, вносили 1% целлюлазы и выдерживали в течение 50–60 мин при постоянном перемешивании. Полученную суспензию центрифугировали, после чего твердую фазу отделяли с последующей сушкой и повторно диспергировали водой. Вторичную водную суспензию доводили раствором 1М NаОН до рН 8,0. Далее в ГБП 2 и ГБП 3 вносили фосфатный буфер и нагревали до t 50–55 °C, после чего вносили 0,5% лактата кальция от массы суспензии и 1,5% протеазы от массы сухого остатка первичного гидролиза. Полученную суспензию выдерживали в течение 1,5 часов, при постоянной t и перемешивании, после чего центрифугировали при 10000× g, 5 мин, 20° и фильтровали с последующей сушкой сухого остатка.

Разработка параметров контролируемого ферментативного гидролиза с применением комбинации протеазы, целлюлазы и лактата кальция позволит получить гидролизат белка гороха с заданной степенью гидролиза (СГ) и определенными функционально-технологическими свойствами (растворимость, эмульгирующая и пенообразующая способность), а также высокой биодоступностью и сниженной антигенной активностью. Схема выделения белка из семян гороха представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема получения гидролизата белка гороха Figure 1. Scheme for obtaining pea protein hydrolysate

Первым этапом получения гидролизата белка гороха является промывание зерен гороха проточной водой и измельчение до частиц размером 250–300 мкм, с последующим их диспергированием в воде в соотношении 1:10 для получения основной суспензии. После чего проводили 3 параллельных варианта гидролиза белка:

В первом варианте (ГБГ1) водную суспензию выдерживают в течение 2 часов при 25 °С, после чего центрифугируют при 10000× g, 5 мин, 20° и фильтруют с последующей сушкой сухого остатка;

Во втором варианте водную суспензию доводят раствором 1М NаОН до рН 8,0, вносят фосфатный буфер и нагревают до t 50–55 °C, после чего вносят 0,5% лактата кальция от массы суспензии и 1,5% протеазы от массы измельченных зерен гороха. Полученную суспензию выдерживают в течение 1,5 часов, при постоянной t и помешивании. После чего нагревают 80 °C в течение 5 минут, центрифугируют при 10000 • g, 5 мин, 20° с последующей сушкой сухого остатка;

В третьем варианте (ГБГ3) первичную суспензию доводят раствором 10% лимонной кислоты до рН 5,4–6,0, после чего нагревают до 50–60 °C, вносят амилазу из расчёта 0,3–0,6 мл/кг и выдерживают в течение 50–60 мин при постоянном помешивании. Полученную суспензию нагревают до 75–80 °C в течение 5 минут, центрифугируют, отделяют твердую фазу и повторно диспергируют водой.

Вторичную водную суспензию доводят раствором 1М NаОН до рН 8,0, вносят фосфатный буфер и нагревают до t 50–55 °C, после чего вносят 0,5% лактата кальция от массы суспензии и 1,5% протеазы от массы сухого остатка первичного гидролиза. Полученную суспензию выдерживают в течение 1,5 часов, при постоянной t и помешивании. После чего нагревают 80 °C в течение 5 минут, центрифугируют при 10000× g, 5 мин, 20° с последующей сушкой сухого остатка.

Результаты и обсуждение

Физико-химические показатели образцов белка гороха, полученного различными способами представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты получения гидролизата белка гороха

Table 1.

Results of obtaining pea protein hydrolysates

Показатель | Indicator	ГБГ 1	ГБГ 2	ГБГ 3
Выход, г | Yield, g	28,5 ± 0,2	24,1 ± 0,2	16,8 ± 0,2
Массовая доля влаги, % | Moisture content, %	8,2 ± 0,2	7,5 ± 0,2	5,5 ± 0,2
Массовая доля белка, % | Protein content, %	27,5 ± 0,2	55,8 ± 0,2	70,5 ± 0,2
Массовая доля аминного азота, мг/100 г Amino nitrogen content, mg/100 g	134,62 ± 6,73	329,41 ± 16,47	698,66 ± 34,93
Степень гидролиза, % | Degree of hydrolysis, %	-	9,77	13,41

Анализ результатов получения гидролизатов белка гороха показал, что применение только протеазы (ГБГ 2) позволило повысить массовую долю белка с 27,5% до 55,8% по сравнению с контролем (ГБГ 1). При этом наибольшая эффективность достигнута при комбинированной обработке амилазой и протеазой (ГБГ 3), где содержание белка достигло 70,5% при степени гидролиза 21,2%. Снижение выхода продукта с 28,5 г до 16,8 г подтверждает эффективное удаление основных небелковых компонентов (крахмала и клетчатка) в процессе ферментативного гидролиза, что доказывает эффективность последовательной ферментативной обработки для получения высокобелкового концентрата из гороха.

Проведённое исследование подтверждает эффективность применения комбинированных ферментативных подходов для выделения и концентрирования белка из растительного сырья, в частности из гороха. Использование протеазы в сочетании с лактатом кальция позволяет увеличить содержание белка в продукте более чем в два раза по сравнению с контрольным образцом, а последовательная обработка амилазой и протеазой обеспечивает максимальное очищение от углеводных компонентов, повышая массовую долю белка до 70,5%.

Ключевыми преимуществами предложенной технологии являются:

─ Значительное увеличение выхода белка и степени его гидролиза.

─ Удаление антипитательных факторов и балластных веществ (крахмала, клетчатки).

─ Улучшение функциональных свойств белка (растворимость, стабильность).

─ Безопасность и экологичность применяемых реагентов (ферменты, лактат кальция), разрешённых для использования в пищевой промышленности.

Таким образом, разработанный метод комбинированного ферментативного гидролиза представляет собой перспективное решение для производства высококачественных растительных белковых концентратов и гидролизатов. Эти ингредиенты могут быть использованы в производстве функциональных продуктов питания, спортивного питания, а также в качестве альтернативы животным белкам в условиях растущего спроса на растительные продукты. Дальнейшие исследования могут быть направлены на оптимизацию параметров процесса, изучение влияния полученных белков на органолептические свойства конечных продуктов и оценку их биологической ценности in vivo.