Эффективность оценки степени метилирования генов APC, GSTP1 и RASSF1A как маркеров рака предстательной железы

Автор: Абоян И.А., Федотова Е.Н., Максимов А.Ю., Комарова Е.Ф.

Журнал: Ульяновский медико-биологический журнал @medbio-ulsu

Статья в выпуске: 3, 2022 года.

Бесплатный доступ

Рак предстательной железы (РПЖ) представляет собой одно из наиболее распространенных онкозаболеваний, занимающее четвертое место в мировой структуре смертности. В связи с отсутствием клинических проявлений на ранних стадиях, а также низкой специфичностью существующих методов дифференциальной лабораторной диагностики актуальным остается поиск чувствительных малоинвазивных маркеров рака предстательной железы. Целью настоящего исследования стал анализ уровней метилирования генов APC, GSTP1 и RASSF1A в биологическом материале при патологиях предстательной железы и эффективности их применения для выявления РПЖ. Материалы и методы. Для молекулярно-генетического исследования уровня метилирования APC, GSTP1 и RASFF1А методом МС-ПЦР использовали геномную ДНК, выделенную из образцов постмассажной мочи, плазмы крови и биопсийного материала пациентов с РПЖ (n=34) и доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) (n=27). Контрольную группу составили 20 мужчин без выявленной патологии. Анализ продуктов МС-ПЦР осуществляли путем проведения электрофореза в 2 % агарозном геле. Результаты. Наиболее часто во всех изученных типах биологического материала отмечается средняя степень метилирования APC, GSTP1 и RASFF1А. Имеются статистически значимые различия между группами с патологиями ПЖ с учетом биологического материала. Оценка отношения шансов выявления РПЖ показала, что наличие гиперметилированного APC в постмассажной моче, гена GSTP1 в плазме крови и гена RASFF1А в биопсийном материале увеличивает вероятность обнаружения РПЖ в 2,5, 12,1 и 4,1 раза соответственно. Показана низкая чувствительность (55,3 %) и высокая специфичность (87 %) диагностики РПЖ по уровню метилирования гена APC в образцах постмассажной мочи, гена GSTP1 в плазме крови, а также гена RASFF1А в биопсийном материале. При сочетанном использовании статуса метилирования изученных генов чувствительность составила 65,2 %, а специфичность - 82,4 %, а при добавлении в панель значения общего простатспецифического антигена (ПСА) - 79,1 и 82, 9 % соответственно. Выводы. Уровни метилирования APC в образцах постмассажной мочи, GSTP1 в плазме крови и RASSF1A в биопсийном материале могут быть рассмотрены в качестве высокоспецифичных диагностических маркеров РПЖ. Совместное применение данных показателей увеличивает специфичность диагностики в сравнении с определением уровня инициального ПСА, а при включении в панель последнего увеличивает также чувствительность панели для выявления РПЖ.

Еще

Рак предстательной железы, apc, gstp1, rassf1a, метилирование, постмассажная моча

Короткий адрес: https://sciup.org/14125359

IDR: 14125359 | DOI: 10.34014/2227-1848-2022-3-73-85

Текст научной статьи Эффективность оценки степени метилирования генов APC, GSTP1 и RASSF1A как маркеров рака предстательной железы

Введение. Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто диагностируемых злокачественных образований, занимающим четвертое место в мировой структуре смертности мужского населения [1]. Использование простатспецифического антигена (ПСА) в качестве диагностического маркера позволило увеличить частоту обнару-

жения РПЖ на ранних стадиях, что привело к увеличению прижизненной постановки диагноза до 16 % [2]. Однако данный метод обладает низкими специфичностью и чувствительностью, что нередко приводит к гипертерапии ложноположительных пациентов и проведению необязательной биопсии [3]. До 30 % случаев РПЖ могут быть диагностированы в диа-

Таблица 1

Table 1

Inclusion and exclusion criteria

Критерии включения Inclusion criteria	возраст <75 лет age <75
	первично обратившиеся пациенты, отсутствие лечения newly-admitted patients, no treatment
	ПСА 2,5–10 нг/мл PSA 2,5–10 ng/ml
Критерии исключения Exclusion criteria	ПСА >10 нг/мл; PSA >10 ng/ml
	декомпенсированная сопутствующая соматическая патология decompensated concomitant somatic pathology
	признаки острого или обостренного хронического простатита на момент обследования signs of acute or exacerbate chronic prostatitis at the moment of examination
	лабораторные или клинические признаки острого воспаления мочевых путей laboratory and clinical signs of acute inflammation of the urinary tract
	наличие хронической болезни почек chronic kidney disease

Таблица 2

Table 2

APC methylation level and frequency in the studied groups

Степень метилирования APC APC methylation level	Вид биологического материала Type of biological material			χ² (р)
	Биоптат Biopsy	Моча Urine	Плазма Plasma
Больные РПЖ (n=34) Patients with prostate cancer (PC) (n=34)
Высокая High	0	4 (11,8 %)	0	9,818 (0,049)

Степень метилирования APC APC methylation level	Вид биологического материала Type of biological material			χ² (р)
Степень метилирования APC APC methylation level	Биоптат Biopsy	Моча Urine	Плазма Plasma
Средняя Medium	0	1 (2,9 %)	0
Низкая Low	34 (100 %)	29 (85,3 %)	34 (100 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
		χ² (р) РПЖ/контроль – 6,154 (0,047) χ² (р) PC/control – 6,154 (0,047)
Пациенты с ДГПЖ (n=27) Patients with benign prostatic hyperplasia (BPH)
Высокая High	0	0	0	4,308 (0,366)
Средняя Medium	0	3 (11,1 %)	0
Низкая Low	27 (100 %)	24 (88,9 %)	27 (100 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
		χ² (р) ДГПЖ/контроль – 5,231 (0,039) χ² (р) BPH/control – 5,231 (0,039)
		χ² РПЖ/ДГПЖ – 16,532 (р=0,001) χ² PC/BPH – 16,532 (р=0,001)
Контрольная группа (n=20) Control group (n=20)
Высокая High	-	0	0	5,154 (0,421)
Средняя Medium	-	0	1 (4 %)
Низкая Low	-	20 (100 %)	19 (96 %)
Отсутствие No methylation	-	0	0

Примечание. Здесь и далее приведены только статистически значимые межгрупповые различия, определенные с помощью критерия χ² Пирсона.

Note. Here and below, only statistically significant intergroup differences are given. Pearson's χ² test is used.

При изучении метилирования гена GSTP1 в группе пациентов с РПЖ с наибольшей частотой средняя степень метилирования наблюдалась в образцах постмассажной мочи, а

наибольшая частота низкой степени метилирования была зарегистрирована в образцах плазмы крови (табл. 3).

Таблица 3

Table 3

GSTP1 methylation level and frequency in the studied groups

Степень метилирования GSTP1 GSTP1 methylation level	Вид биологического материала Type of biological material			χ² (р)
Степень метилирования GSTP1 GSTP1 methylation level	Биоптат Biopsy	Моча Urine	Плазма Plasma	χ² (р)
Больные РПЖ (n=34) Patients with PC (n=34)
Высокая High	5 (14,7 %)	0	3 (8,8 %)	15,872 (<0,01)
Средняя Medium	21 (61,7 %)	28 (82,4 %)	18 (52,9 %)
Низкая Low	8 (23,6 %)	6 (17,6 %)	13 (38,2 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
		χ² (р) РПЖ/контроль – 23,442 (р<0,01) χ² (р) PC/control – 23,442 (р<0,01)	χ² (р) РПЖ/контроль – 15,524 (р=0,002) χ² (р) PC/control – 15,524 (р=0,002)
Пациенты с ДГПЖ (n=27) Patients with BPH (n=27)
Высокая High	0	0	3 (11,1 %)	5,461 (0,244)
Средняя Medium	16 (59,2 %)	15 (55,6 %)	16 (59,3 %)
Низкая Low	11 (40,7 %)	12 (44,4 %)	8 (29,6 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
		χ² (р) ДГПЖ/контроль – 13,863 (р<0,001) χ² (р) BPH/control – 13,863 (р<0,001)	χ² (р) ДГПЖ/контроль – 17,910 (р<0,001) χ2 (р) BPH/control – 17,910 (р<0,001)
		χ² (р) РПЖ/ДГПЖ – 3,987 (р=0,046) χ² (р) PC/BPH – 3,987 (р=0,046)
Контрольная группа (n=20) Control group (n=20)
Высокая High	-	0	0	4,257 (0,538)
Средняя Medium	-	0	0
Низкая Low	-	16 (80 %)	14 (70 %)
Отсутствие No methylation		4 (20 %)	6 (30 %)

В группе пациентов с ДГПЖ высокая степень метилирования промотора гена GSTP1 наблюдалась только в образцах плазмы крови (табл. 3). В образцах плазмы крови и постмассажной мочи условно здоровых мужчин наблюдалась низкая степень метилирования гена GSTP1 в 70 % и 80 % случаев соответственно, а в остальных случаях зафиксировано отсутствие метилирования (табл. 3).

При сравнении степени метилирования гена GSTP1 при различных состояниях ПЖ в образцах постмассажной мочи были выявлены статистически значимые различия как между пациентами с патологией предстательной железы и условно здоровыми, так и между больными РПЖ и пациентами с ДГПЖ (табл. 3). В образцах плазмы крови также обнаружены

различия между группой обследуемых с патологией ПЖ и группой контроля, однако в группах пациентов с РПЖ и ДГПЖ статистически значимые различия по степени метилирования данного гена отсутствовали (табл. 3).

При оценке метилирования гена RASFF1А обнаружено, что в группе больных РПЖ высокая степень метилирования наблюдалась только в одном образце постмассажной мочи, в биопсийном материале преобладала средняя степень метилирования (82,3 %), а в моче и плазме – низкая (55,9 % и 61,8 % соответственно) (табл. 4). В группе пациентов с ДГПЖ в образцах биоптатов и постмассажной мочи преобладала низкая степень метилирования, в то время как в образцах плазмы крови – средняя (табл. 4).

Таблица 4

Table 4

Степень и частота метилирования гена RASFF1А в исследуемых группах

RASFF1А methylation level and frequency in the studied groups

Степень метилирования RASFF1А RASFF1А methylation level	Вид биологического материала Type of biological material			χ² (р)
Степень метилирования RASFF1А RASFF1А methylation level	Биоптат Biopsy	Моча Urine	Плазма Plasma	χ² (р)
Больные РПЖ (n=34) Patients with PC (n=34)
Высокая High	0	1 (2,9 %)	0	13,326 (0,012)
Средняя Medium	27 (82,3 %)	14 (41,2 %)	13 (38,2 %)
Низкая Low	7 (18,6 %)	19 (55,9 %)	21 (61,8 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
Пациенты с ДГПЖ (n=27) Patients with BPH (n=27)
Высокая High	0	0	0	3,762 (0,315)
Средняя Medium	6 (21 %)	11 (41 %)	16 (59 %)
Низкая Low	21 (79 %)	16 (59 %)	11 (41 %)
Отсутствие No methylation	0	0	0
	χ² (р) РПЖ/ДГПЖ – 4,259 (p=0,004) χ² (р) PC/BPH – 4,259 (p=0,004)

Степень метилирования RASFF1А RASFF1А methylation level	Вид биологического материала Type of biological material			χ² (р)
Степень метилирования RASFF1А RASFF1А methylation level	Биоптат Biopsy	Моча Urine	Плазма Plasma	χ² (р)
Контрольная группа (n=20) Control group (n=20)
Высокая High	-	0	0	5,154 (0,421)
Средняя Medium	-	0	0
Низкая Low	-	14 (70 %)	15 (75 %)
Отсутствие No methylation	-	6 (30 %)	5 (25 %)

Таблица 5

Table 5

Расчет величин отношения шансов выявления РПЖ с 95 % доверительным интервалом по показателям метилирования генов APC , GSTP1 , RASFF1А в группах с патологиями предстательной железы

Odd ratio of prostate cancer detection with a 95 % confidence interval according to APC, GSTP1, RASFF1A methylation in patients with prostate pathologies

	APC , моча APC , urine	GSTP1 , плазма GSTP1 , plasma	RASFF1А , биоптат RASFF1А , biopsy
Отношение шансов (OR) Odd ratio (OR)	2,529	12,115	4,137
Стандартная ошибка отношения шансов (S) Root-mean-square error of odd ratio	0,768	0,789	0,692
Нижняя граница 95 % ДИ (CI) Lower limit 95 % CI	0,561	2,580	1,468
Верхняя граница 95 % ДИ (CI) Upper limit 95 % CI	11,403	56,88	9,034

Примечание. ДИ – доверительный интервал.

Note. CI – confidence interval.

Таблица 6

Table 6

Чувствительность и специфичность методики выявления РПЖ по показателям метилирования генов APC , GSTP1 , RASFF1А и ПСА

Sensitivity and specificity of prostate cancer detection according to APC , GSTP1 , RASFF1A methylation and PSA

Была проведена оценка чувствительности и специфичности изученных ДНК-маркеров для того типа биологического материла, в котором были показаны статистически значимые различия между РПЖ и ДГПЖ, для каждого маркера отдельно и в комбинации (табл. 6). Анализ продемонстрировал низкую чувствительность и высокую специфичность неинвазивной диагностики РПЖ по уровню метилирования гена APC в образцах постмассажной мочи и гена GSTP1 в плазме крови. При этом определение степени метилирования гена RASFF1А в биопсийном материале может использоваться для отличия злокачественных и доброкачественных дисплазий ПЖ с 55,3 % чувствительностью и 87 % специфичностью. При сочетанном использовании статуса метилирования изученных генов чувствительность составила 65,2 %, специфичность – 82,4 %, а при добавлении в панель значения ПСА – 79,1 и 82,9 % соответственно (табл. 6).

Обсуждение. Анализ статуса метилирования промоторов генов APC, GSTP1 и RASFF1А показал, что наиболее часто во всех изученных типах биологического материала отмечается

средняя степень метилирования. По результатам проведенного исследования по статусу метилирования генов обнаружены статистически значимые групповые различия как между группами с патологиями ПЖ, так и в сравнении с контрольной группой практически здоровых людей. Причем для каждого из изученных генов-супрессоров был выявлен тот тип биологического материала, определение метилирования в котором повышает вероятность обнаружения РПЖ. Так, для гена APC таким биологическим материалом служит постмассажная моча, для гена GSTP1 – плазма крови, для гена RASFF1А – биоптаты опухоли ПЖ. Эти результаты имеют практическую значимость, поскольку обширная внутриопухолевая клональная гетерогенность локализованного и метастатического РПЖ создает проблему отбора образцов в процессе биопсии. Поэтому актуальным является поиск доступных неинвазивных источников материала для проведения молекулярно-генетических исследований при РПЖ. В исследовании Y. Nakai et al. (2014) было продемонстрировано содержание разрушающихся клеток и внеклеточной ДНК из разных участ-

Параметр Parameter Чувствительность, % Sensitivity, % Специфичность, % Specificity, % ПСА, сыворотка PSA, serum 93,0 43,4 APC, моча APC, urine 14,7 93,6 GSTP1, плазма GSTP1, plasma 47,1 90,0 RASFF1А, биоптат RASFF1А, biopsy 55,3 87 APC в моче, GSTP1 в плазме, RASFF1А в биоптате APC in urine, GSTP1 in plasma, RASFF1А in biopsy 65,2 82,4 ПСА, APC в моче, GSTP1 в плазме, RASFF1А в биоптате PSA, APC in urine, GSTP1 in plasma, RASFF1А in biopsy 79,1 82,9 ков ПЖ в образцах постмассажной мочи [12]. В настоящем исследовании были получены результаты, согласующиеся с данными, представленными в зарубежной и отечественной литературе. Наблюдаемая тенденция к низкой степени метилирования APC в образцах постмассажной мочи и GSTP1 в плазме крови, а также высокая специфичность изучаемых показателей согласовались с рядом ранее опубликованных результатов [13–16].

В результате проведенного исследования показана наибольшая чувствительность и специфичность определения гена RASSF1A в образцах биоптатов, что подтверждает выводы А.В. Сивкова и соавт. [17]. При этом авторами была продемонстрирована целесообразность сочетанного использования молекулярно-генетических маркеров и ПСА в связи с гетерогенностью РПЖ. При использовании нами комбинации изученных генов с учетом типа биоматериала также обнаружена высокая чувствительность и специфичность, что свидетельствует о больших предикторных возможностях панели генов для выявления РПЖ в сравнении с определением статуса метилирования отдельных генов. Сочетанное использование степени метилирования генов и показа-

теля общего ПСА повысило обе диагностические характеристики панели относительно оценки статуса метилирования каждого гена отдельно, а также их комбинации. Такие же закономерности были обнаружены в исследовании А. Bakavicius et al. (2019), где было показано увеличение чувствительности и специфичности диагностики РПЖ в образцах постмассажной мочи при сочетанном использовании уровня метилирования генов GSTP1 , RARB , RASSF1 и показателя ПСА [18].

Заключение. Выявленные в проведенном исследовании закономерности позволяют рассматривать повышение уровней метилирования гена APC в образцах постмассажной мочи, GSTP1 в плазме крови и RASSF1A в биопсийном материале в качестве высокоспецифичных диагностических маркеров для выявления рака ПЖ. Совместное применение данных показателей увеличивает специфичность в сравнении с определением уровня инициального ПСА, а при включении в панель последнего увеличивает также чувствительность панели для выявления РПЖ в сравнении с оценкой метилирования генов в отдельности, что позволит оптимизировать диагностику РПЖ и сократить число биопсий.

Список литературы Эффективность оценки степени метилирования генов APC, GSTP1 и RASSF1A как маркеров рака предстательной железы

Jain M.A., Sapra A. Cancer Prostate Screening. In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021.
Strand S.H., Orntoft T.F., Sorensen K.D. Prognostic DNA methylation markers for prostate cancer. Int. J. Mol. Sci. 2014; 15 (9): 16544-16576. DOI: 10.3390/ijms150916544.
Tkac J., Gajdosova V., Hroncekova S., Bertok T., Hires M., Jane E., Lorencova L., Kasak P. Prostate-specific antigen glycoprofiling as diagnostic and prognostic biomarker of prostate cancer. Interface Focus. 2019; 9 (2): 20180077. DOI: 10.1098/rsfs.2018.0077.
Hoogland A.M., Kweldam C.F., van Leenders G.J. Prognostic histopathological and molecular markers on prostate cancer needle-biopsies: a review. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 341324. DOI: 10.1155/2014/341324.
Miyake H., Muramaki M., Kurahashi T., Takenaka A., Fujisawa M. Expression of potential molecular markers in prostate cancer: correlation with clinicopathological outcomes in patients undergoing radical prostatectomy. Urol. Oncol. 2010; 28 (2): 145-151. DOI: 10.1016/j.urolonc.2008.08.001.
Fiano V., Zugna D., Grasso C., Trevisan M., Delsedime L., Molinaro L., Gillio-Tos A., Merletti F., Richi-ardi L. LINE-1 methylation status in prostate cancer and non-neoplastic tissue adjacent to tumor in association with mortality. Epigenetics. 2017; 12 (1): 11-18. DOI: 10.1080/15592294.2016.1261786.
Skorodumova L.O., Babalyan K.A., SultanovR., VasilievA.O., GovorovA.V., Pushkar D.Y., Sharova E.I. The methylation status of GSTP1, APC, and RASSF1 genes in human prostate cancer samples: Comparative analysis of diagnostic informativeness of MS-HRM and hybridization on the Illumina Infinium Hu-manMethylation450 BeadChip. Biochemistry (Moscow), Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2017; 11 (2): 194-201.
Cui J., Li G., Yin J., Li L., Tan Y., Wei H., Liu B., Deng L., Tang J., Chen Y., Yi L. GSTP1 and cancer: Expression, methylation, polymorphisms and signaling (Review). Int. J. Oncol. 2020; 56 (4): 867-878. DOI: 10.3892/ijo.2020.4979.
Patel P.G., Wessel T., Kawashima A., Okello J.B.A., Jamaspishvili T., Guerard K.P., Lee L., Lee A.Y., How N.E., Dion D., Scarlata E., Jackson C.L., Boursalie S., Sack T., Dunn R., Moussa M. A three-gene DNA methylation biomarker accurately classifies early stage prostate cancer. Prostate. 2019; 79 (14): 1705-1714. DOI: 10.1002/pros.23895.
Kaminska K., Biaikowska A., Kowalewski J., Huang S., LewandowskaM.A. Differential gene methylation patterns in cancerous and non-cancerous cells. Oncol. Rep. 2019; 42 (1): 43-54. DOI: 10.3892/or.2019.7159.
ГригорьеваМ.В., Михайленко Д.С., ЕфремовГ.Д., СивковА.В. Диагностическая значимость PCA3 в моче, в зависимости от уровня сывороточного ПСА у обследуемых пациентов. Вестник современных исследований. 2017; 12-1: 25-26.
Nakai Y., Anai S., Kuwada M., Miyake M., Chihara Y., Tanaka N., Hirayama A., Yoshida K., Hirao Y., Fujimoto K. Photodynamic diagnosis of shed prostate cancer cells in voided urine treated with 5-ami-nolevulinic acid. BMC Urol. 2014; 14: 59. DOI: 10.1186/1471-2490-14-59.
Malpeli G., Innamorati G., Decimo I., Bencivenga M., Nwabo Kamdje A.H., Perris R., Bassi C. Methylation Dynamics of RASSF1A and Its Impact on Cancer. Cancers (Basel). 2019; 11 (7): 959. DOI: 10.3390/cancers11070959.
Li M., Wang C., Yu B., Zhang X., Shi F., Liu X. Diagnostic value of RASSF1A methylation for breast cancer: a meta-analysis. Biosci Rep. 2019; 39 (6): BSR20190923. DOI: 10.1042/BSR20190923.
Litovkin K., Van Eynde A., Joniau S., Lerut E., Laenen A., Gevaert T., Gevaert O., Spahn M., Kneitz B., Gramme P., Helleputte T., Isebaert S., Haustermans K., Bollen M. DNA Methylation-Guided Prediction of Clinical Failure in High-Risk Prostate Cancer. PLoS One. 2015; 10 (6): e0130651. DOI: 10.1371/journal.pone.0130651.
Li D., Xu Z., Liu J., PuX., Luo Y., ZhengX. Restriction landmark genomic scanning for screening aberrant CpG methylations in prostate cancer. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2016; 36 (1): 103-108.
Сивков А.В., Кешишев Н.Г., Меринова О.В., Северин С.Е., Савватеева М.В., Кузнецова Е.М., Ка-прин А.Д., Сивков А.В. Маркеры GSTnl, RARB2 и RASSF1A в диагностике рака предстательной железы: результаты исследования. Экспериментальная и клиническая урология. 2016; 4: 38-43.
Bakavicius A., Daniunaite K., Zukauskaite K., Barisiene M., Jarmalaite S., Jankevicius F. Urinary DNA methylation biomarkers for prediction of prostate cancer upgrading and upstaging. Clinical Epigenetics. 2019; 11 (1): 1-10. DOI: 10.1186/s13148-019-0716-z.

Еще

Статья научная