Эффективность получения андрогенных гаплоидов ячменя в зависимости от способа регенерации растений, состава питательной среды и плотности инокуляции пыльников

Как известно, общая схема получения андрогенных гаплоидов предусматривает культивирование пыльников на питательной среде с целью индукции аномального многократного деления гаплоидных микроспор с образованием морфогенных структур, из которых формируются растения-регенеранты [1, 2].

Обычно процесс проходит в два этапа при использовании двух типов сред. Первая среда - индукционная - содержит комплекс физиологически активных веществ, стимулирующих отклонение микроспор от гаметофитного пути развития, их многократное деление и дальнейший каллусогенез или эмбриоидогенез. Состав второй среды – регенерационной – способствует регенерации растений из перенесенных на нее морфогенных структур микроспориального происхождения. При этом наиболее быстрым и экономически выгодным путем получения гаплоидов является эм-бриоидогенез – образование биполярных структур с синхронным развитием апексов корня и стебля непосредственно из многоклеточных микроспор (прямой эмбриоидогенез) или из эмбриогенного каллуса (непрямой эмбриоидогенез) [3].

Следует отметить, что высокая регенерационной способность эмбриоидов, которые могут прорастать на индукционной среде, позволяет получать гаплоиды без использования регенерационной среды, что существенно уменьшает трудоёмкость и способствует экономии материалов.

Нами впервые установлено, что замена агар-агара химически модифицированными [4, 5] и естественными крахмалами [6, 7] в индукционной среде способствовала повышению частоты прямого эмбриои-догенеза и регенерации растений в культуре in vitro пыльников ячменя ярового. В связи с этим целью исследований было изучение возможности одноэтапного получения гаплоидов этого вида растений на крахмалсодержащих средах и определение влияния плотности инокуляции пыльников на эффективность гап-лопродукционного процесса.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве модельного генотипа была использована линия ячменя ярового ( Hordeum vulgare L.) ДГ00-126, полученная методом культуры пыльников in vitro на основе F 1 гибрида Харьковский 74×Экзотик и характеризующаяся высокой частотой образования эмбриоидов, эмбриогенного каллуса и нормально пигментированных растений-регенерантов [8].

Растения, служившие донорами пыльников, выращивали в полевых условиях. Отбор, предобработка колосьев и получение асептической культуры пыльников были проведены по методикам, опубликованным ранее [9, 10].

Пыльники культивировали на индукционных питательных средах [10], различающихся гелеобразующими компонентами. В частности, NMSмод.2 содержала 0,8% агар-агара («Difco», США); NMSsu 2 - 6,5% кукурузного крахмала, полученного из зерна линии АС-11, которая является носителем естественной мутации гена структуры эндосперма su 2 [7]; NMS 5a -12,0% химически модифицированного крахмала Д-5а [5]. Препараты крахмалов были любезно предоставлены С.М. Тымчуком и П.Г. Дульневым.

Пыльники помещали в стеклянные пробирки (10×150 мм) или стерильные пластиковые чашки Петри (d=35 мм). В каждую пробирку на «косячок» среды и в чашку Петри высаживали по 30-45 шт пыльников, вычлененных из одного колоса. В эксперименте по изучению влияния на показатели гаплопродукции плотности инокуляции пыльников в одну пробирку высаживали пыльники, изолированные из половины колоса.

Наблюдения за индукцией и развитием морфогенных структур проводили через каждые 5-7 сут, начиная с 20-х сут с момента инокуляции пыльников. Последний подсчет количества морфогенных пыльников в обоих вариантах опыта был проведен на 35 сут от начала культивирования пыльников, после чего в контроле была проведена пересадка каллуса и эмбриоидов на среду для регенерации. Подсчет растений-регенерантов был проведен через две недели после пересадки в контроле и одновременно в варианте «без пересадки».

Регенерационная среда содержала соли макро– и микроэлементов по Мурасиге и Скугу [11], а также (в мг/л): мио-инозитол – 100; витамины В1, В6 и РР – по 0,5; ИУК и БАП – по 0,2, (витамины и фитогормоны – «Serva», Германия); глутамин – 100 («PRS-CODEX», Испания); сахарозу – 30 г/л («Merck», Германия), агар-агар – 0,8% («Difco», США); pH 5,7-5,8.

Показателями эффективности экспериментального андрогенеза in vitro служили количество морфогенных пыльников, зеленых и хлорофиллдефектных растений в процентах от общего количества пыльников, высаженных на среду. В варианте «без пересадки» также было определено количество дифференцированных эмбриоидов, которые не проросли.

Экспериментальные данные обработаны при помощи методов дисперсионного анализа и вариационной статистики [12] с использованием пакета программ «ОСГЭ».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наблюдения показали, что через 20 сут после инокуляции пыльников на питательную среду имело место интенсивное образования морфогенных макроструктур – каллуса и эмбриоидов на всех средах. Затем в пробирках с агаровой NMSмод.2 и крахмалсодержащей средой NMSsu 2 , которые были оставлены для обноэтапного получения гаплоидов, происходило разрастание каллуса с формированием сплошной массы, среди которой были видны эмбриоды, и пророс-тание последних з образованием растений-регенерантов (рис. 1)

а)

б)

Рис. 1. Регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 на индукционной среде: а - с химически модифицированным крахмалом Д-5а; б - с агар-агаром через 40 сут после инокуляции пыльников

Результаты эксперимента (табл. 1) свидетельствуют о том, что в целом не удалось решить поставленную задачу по получению растений без пересадки морфогенных структур на регенерационную среду. Отсутствие достоверных различий по количеству эмбриогенных пыльников на средах с однотипным гелеобразователем можно считать подтверждением одинаковых стартовых условий про- цесса регенерации растений. Однако высокая частота индукции андрогенных структур и интенсивный рост каллуса, которые свойственны линии ДГ00-126, при ограниченной площади питания в вариантах «без пересадки» привели, очевидно, к конкуренции между ними и потере способности к регенерации, в том числе и эмбриоидами. Так, на обеих средах не проросло более 22% эмбриоидов.

Таблица 1 . Индукция морфогенных структур и регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от способа регенерации растений и гелеобразующего компонента питательной среды (2009 г.)

Среда	Высажено пыльников, шт .	Получено
		морфогенных пыльников		зеленых растений-регенерантов		растений-альбиносов		количество эмбриоидов3
		шт.	%	шт.	%	шт.	%	%
NMSмод.2(п)1	248	102	41,13	66	26,61	37	14,92	–
NMSмод.2 (бп)2	152	56	36,84	23	15,13	44	28,97	23,11
NMSsu 2 (п)1	225	74	32,89	88	39,11	24	10,67	–
NMSsu 2 (бп)2	167	52	31,13	15	8,98	16	9,58	22,15
НСР 05			9,45		8,17		6,98	–

Прим. NMSмод.2 - 0,8 % агар-агара; NMSsu 2 – 6,5 % кукурузного крахмала типа su 2 . 1 - морфогенные структуры пересаживали на среду для регенерации; 2 - регенерация происходила на индукционной среде без пересадки; 3 - эмбриоиды, которые не проросли на индукционной среде

Следует отметить, что более интенсивный рост каллуса наблюдался на среде, содержавшей su 2 -крахмал, и следствием «перерастания» культуры было многократное уменьшение частоты регенерации растений. Поскольку в ходе эксперимента выяснилось, что проблемой одноэтапного получения гаплоидов ячменя является высокая интенсивность роста каллуса с низкой регенерационной способностью, который заполняет весь объем пробирки, препятствуя реализации морфогенетического потенциала культуры, логичными шагами в направлении повышения выхода растений-регенерантов представлялось использование компонентов питательной среды, которые снижают скорость нарастания каллусной массы, а также увеличение площади питания за счет уменьшения плотности инокуляции пыльников.

Принимая во внимание то, что на питательных средах, которые содержали вместо агар-агара химически модифицированные крахмалы, наряду со стимуляцией прямого эмбриоидогенеза снижался рост каллуса [7, 8], один из этих препаратов – Д-5а - был использован для разработки методики одноэтапного получения гаплоидов ячменя. В качестве культуральных сосудов были использованы чашки Петри, что обеспечивало большую площадь питания для развивающихся морфогенных структур.

Исследования показали, что увеличение площади питания на агаровой среде привело к нивелированию различий по показателям гаплопродукции в вариантах «пересадка» и «без пересадки» андрогенных структур на среду для регенерации (табл. 2). При использовании химически модифицированного крахмала Д-5а в индукционной среде в сочетании с пересадкой морфогенных структур на регенерационную среду с агаром отмечено существенное возрастание частоты регенерации зеленых растений. В то же время при обноєтапном получении гаплоидов эффективность регенерации была почти в 8 раз ниже.

Таблица 2 . Индукция морфогенных структур и регенерация растений в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от способа регенерации растений и гелеобразующего компонента питательной среды (2010 г.)

Среда	Высажено пыльников, шт .	Получено
		морфогенных пыльников		зеленых растений-регенерантов		растений-альбиносов
		шт.	%	шт.	%	шт.	%
NMSмод.2(п)1	304	144	47,36	81	26,64	16	5,26
NMSмод.2 (бп)2	382	187	48,95	99	25,91	13	8,15
NMS 5а (п)1	383	149	38,90	216	56,39	55	14,36
NMS 5а (бп)2	309	129	41,74	23	7,44	13	4,21
НСР 05			3,69		3,13		0,97

Прим. NMSмод.2 - 0,8 % агар-агара; NMS5а – 12,0 % химически модифицированного крахмала Д-5а. 1 - морфогенные структуры пересаживали на среду для регенерации; 2 - регенерация происходила на индукционной среде без пересадки

Это было связано с тем, что гель из крахмала Д-5а обладал более низкой по сравнению с агаровым водоудерживающей способностью, и высыхание среды снижало частоту прорастания эмбриодов (не проросло более 45 % эмбриодов). Следует отметить, что на среде, содержавшей крахмалД-5а, формировались более мелкие эмбриоды, значительная часть которых прекращала развитие на глобулярной стадии (рис. 1). В варианте «пересадка» такие структуры переносили на агаровую среду для регенерации вместе с пыльником, что способствовало их дифференциации и прорастанию с формированием растений нормальной морфологии, лишенных, к тому же, признаков витрификации.

Ввиду высокой стоимости стерильных чашек Петри одноразового использования, был проведен эксперимент по изучению влияния на эффективность регенерации растений плотности инокуляции пыльников с применением в качестве культуральных сосудов пробирок. Как видно из результатов, представленных на рис. 2, при культивировании на среде с агар-агаром пыльников, изолированных из одного колоса с пересадкой полученных андрогенных структур на регенерационную среду (КП) и без пересадки (КБП), а также в аналогичных вариантах, но с инокуляцией на среду пыльников, вычлененных их половины колоса (½ КП и ½ КБП), получены сравнимые результаты по количеству морфогенных пыльников. Однако при снижении плотности высаженных пыльников (варианты ½ КП и ½ КБП) отмечено существенное увеличение частоты регенерации нормально пигментированных растений, обусловленное более благоприятными условиями для дифференции и прорастания эмбриоидов.

Впервые изучена возможность одноэтапного получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников in vitro при использовании в качестве гелеобразо-вателей индукционной среды агар-агара, высоко-амилозного кукурузного крахмала из зерна линии-носителя мутантного гена структуры эндосперма su2 и химически модифицированного крахмала Д-5а. На средах с агар-агаром и кукурузным крахмалом в вариантах без пересадки морфогенных структур на регенерационную среду отмечен активный рост неэмбриогенного каллуса, что привело к снижению регенерационной способности культуры. Замена агар-агара химически модифицирован- ным крахмалом Д-5а угнетала дифференциацию и прорастание эмбриоидов на индукционной среде, но в то же время способствовала существенному увеличению частоты регенерации растений при пересадке морфогенных структур на регенерацион- ную среду с агар-агаром. Одноэтапное получение гаплоидов ячменя может быть достигнуто при снижении плотности инокуляции пыльников на агаровой среде.

а)

б)

Рис. 2. Индукция морфогенных структур (а) и регенерация растений (б) в культуре пыльников in vitro линии ячменя ярового ДГ00-126 в зависимости от плотности инокуляции пыльников на питательную среду и способа регенерации. К – изолированы пыльники одного колоса, ½ К – половины колоса; П – пересадка морфогенных структур; БП – без пересадки