Эффективность протеаз панкреатина и трипсина при ферментативном гидролизе коллагена

Развитие реконструктивной медицины на базе тканевой инженерии связано прежде всего с созданием новых материалов высокой функциональности, способных имитировать биологические, структурные и физические функции естественных тканей организма. В настоящее время существует высокая потребность в продуктах тканевой инженерии, в том числе в продуктах скаффолд-технологий. Основная технология использования скаффолдов – заселение клетками непосредственно перед имплантацией или во время нее [1–7]. В то же время одной из ключевых проблем при использовании даже идеального источника клеточного материала является необходимость создания подходящего искусственного биомиметического матрикса. В связи с этим основной задачей тканевой инженерии является создание клеточных матриц (скаффолдов) с последующим образованием сложных клеточных композиций, подобных ткани или органу, для дальнейшей трансплантации их пациенту взамен поврежденных или утраченных. Для создания скаф-фолдов предлагают использовать природные и синтетические полимеры. Чаще других в случае биополимеров используют белки, такие как коллаген, фибрин, фиброин шелка и др. При получении скаффолдов применяют протеолитические ферменты [8–11], гидролизующие пептидную связь белков с целью образования новых связей уже в скаффолде, при этом отмечается влияние молекулярно-массовых характеристик (ММХ) используемого полимера на свойства получаемых матриц [12–14]. Изменения молекулярных и надмолекулярных параметров биополимеров клеточных матриц при формировании скаффолдов, влияние этих параметров на биомиметические свойства при построении тканеинженерных конструкций зависят не только от природы используемого белкового материала, но и от природы фермента [15, 16]. Варьирование фермента может позволить при построении тканеинженерных конструкций моделировать характеристики скаф-фолдов.

Разрабатываемые клеточные матрицы, имитирующие естественный внеклеточный матрикс, должны обеспечивать достаточную временную механическую поддержку для развития ткани и обладать физиологической активностью, достаточной для развития межклеточных контактов, но в то же время подвергаться естественной резорбции с трансформацией в натуральный внеклеточный матрикс [3, 17]. Использование коллагена I типа широко распространено при создании скаффолдов, так как он имеет несколько преимуществ, позволяющих использовать данный биополимер для получения продуктов тканевой инженерии: биосовместимость, волокнистая структура, хорошая сочетаемость с другими материалами, биодеградируемость [2, 3, 18, 19].

Однако нативный коллаген представляет собой быстро разлагаемый биополимер из-за своей фибриллярной волокнистой структуры. Но в сочетании с другими синтетическими и природными полимерами этот недостаток с легкостью устраняется, более того, наблюдается увеличение жесткости и упругости гибридного материала в условиях ферментативного разрушения нативных молекул белка [13, 20, 21]. Ранее было установлено, что при гидролизе нативного высокомолекулярного коллагена I типа, выделенного из кожных покровов разных животных, в стандартных условиях в присутствии панкреатина происходит гидролиз с достаточно высокой скоростью [22].

Целью данного исследования является сравнение ММХ рыбного коллагена (РК) в процессе гидролиза в присутствии многокомпонентного фермента панкреатина, в состав которого входят протеолитические ферменты трипсин, пепсин, и химотрипсин, а также только трипсина в условиях, близких к условиям формирования скаффолдов [23]. Главной задачей при этом стал контроль ММХ гидролизата коллагена в течение длительного времени.

Экспериментальная часть

В работе использовали коммерческие ферменты: панкреатин [Хубей Максфарм Индастриз Ко. Лтд (Китай)], трипсин [ООО НПП «ПанЭко»], AcOH (ХЧ). Высокомолекулярный рыбный коллаген (РК) выделяли по методу [24].

При проведении ферментативного гидролиза использовали 1%-ный раствор РК. К раствору высокомолекулярного РК добавляли 1М NaOH для достижения нейтральной среды и доводили дистиллированной водой до определенного объема. Гидролиз в присутствии ферментов проводили при фермент-субстратном соотношении коллаген : фермент = 10:1, добавляя к полученной смеси фермент. Из реакционной среды брали пробы (1 мл) через определенные промежутки времени после добавления фермента. Для прерывания гидролиза в пробы приливали 4%-ный раствор AcOH.

Молекулярно-массовые характеристики проб гидролизата РК определяли методом ГПХ с применением высокоэффективного жидкостного хроматографа фирмы Shimadzu CTO20A/20AC (Япония) с программным модулем LC-Solutions-GPC. Разделение проводили с применением колонки Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWxl с диаметром пор 5 мкм. В качестве детектора применяли низкотемпературный светорассеивающий детектор ELSD-LT II. Элюентом служил 0,5 М раствор уксусной кислоты. Скорость потока 0,8 мл/мин. Для калибровки использовали узкодисперсные образцы декстрана с диапазоном молекулярных масс (ММ) 1 000– 410 000 Да (Fluca).

Обсуждение результатов

В соответствии с п ос та в л енной в исследовании целью проводили анал и з М МХ (ММ и КП) г идроли за т а Р К в п роц е с с е ферментативного гидролиза при комнатной тем п е ра ту ре . Ок а за лось, ч т о ос н овн ая час ть в ыс о комол екулярного РК гидролизуется в течение первой ми н уты к а к в с л учае панкреатина, так и три п с и н а (ри с . 1 ) . При использовании панкреатина образуется три фракции ги д ролиза та Р К с ММ мен е е 70 к Д а ( 13 –15 %), с ММ ~ 17,5 кДа (2,0–3,5 %) и ММ ~ 9 кДа (83–84 %), в с лу ча е ж е три п с и на н аблюдается еще небольшая олигомерная фрак ц и я (~ 1,0 %) с ММ ~ 300 Да , а фр а к ц ия и с ход н ого н а ти в н о го Р К с М М ~ 300 кДа отсутствует. То есть действ и е п а н к ре а ти н а и три п с ин а п риводит к полному разрушению исходного на ти в н ого Р К д о н и зкомол е к у лярн ых фра к ц и й у же в течение первой минуты, что свидетельствует о высокой эффективн ости ги дрол иза в п ри с у тс тв и и у к а за н н ых ферме н т ов .

Рис. 1. Изменение молекулярной массы разных фракций при гидролизе РК панкреатином: 1 – фракция с ММ выше 17 кДа; 2 – фракция с ММ ~ 17 кДа; 3 – фракция с ММ ~9 кДа

Интересно о т ме ти ть, что наблюдается образование двух низкомолекулярн ых фрак ц и й ги д р олизата со значениями ММ ~ 17 кДа и ~ 9 кДа для обоих ферментов, при че м д оля п о с ле дн ей ф ра кци и в ра створе боль ш е 80 % (рис. 1, 2). Последующий контроль ММХ в течение трех часов показа л ( с м. ри с. 1, 2) , что п роисходит медленное уменьшение первой фрак ц и и с М М в ы ше 17 к Да д о полн ог о и с че з н ов е ния за трое суток (кривые 1 на рис. 3, 4), соде ржа н ие в торой фра кции с ММ ~ 1 7 кД а н е много у в еличивается вначале и для панкреатина, и дл я т ри п с и н а , х отя конц ентраци я фр а к ц и и н е много различается в образцах гидролизата разными ф е рме н та ми ( к ри в ы е 2 н а ри с . 3, 4) , а за те м и зме н яе т ся мало, содержание низкомолекулярной фр а к ц и и с ММ ~ 9 кДа п осте п е н н о ув е л и чи вае тся ( к ри в ые 3 н а ри с . 1, 2) . Оли гоме рн а я фрак ц и я в растворе с трипсином со в ре ме не м и с че з а е т, в ид и мо, за счет разрушения до неконтролируемых ме тод ом а ми н ок и слот (к ри в а я 4 н а ри с . 4) . В обра зц а х через трое суток в растворе с панкреатином ос та е т с я толь к о гидр оли з ат Р К с ММ ~ 9 к Да ( с м. ри с . 1) в с лу ча е гидролиза трипсином доля его составляет ~ 90 % (~ 10 % РК с ММ ~ 17 кДа ) . Т о ес ть н а блю да е тс я ра зру ш е н и е и с ход н о го высокомолекулярного коллагена с о б ра зов а н и ем д в ух низкомолекулярных фракций (рис. 5, 6). О б ращает на себя внимание небольшое различие в с оотношениях фракций гидролизатов на разн ых ста д и ях ги д ро ли за п ри и с п ол ьзовани и у к а зан н ых ферментов, которое может отразиться на строе н и и ск а ф фол д а в п роц е сс е его форми ров ани я (рис. 1, 2). В табл. 1, 2 приведены значения ММ и КП в процессе гидролиза, свидетель с тв у ю щ и е об о д н ород н о с ти фрак ц и й – коэффициенты полидисперсности (К П ) имею т значени я п реи му щ е с тв е н н о н е б ол е е 1,2.

Рис. 2. Изменение молекулярной массы разных фракций при гидролизе РК трипсином: 1 – фракция с ММ выше 17 кДа; 2 – фракция с ММ ~ 17 кДа; 3 – фракция с ММ ~ 9кДа;

4 – олигомерная фракция с ММ ~ 0,3 кДа

Рис. 3. Доля разных фракций при гидролизе РК панкреатином: 1 – фракция с ММ выше 17 кДа; 2 – фракция с ММ ~ 17 кДа;

3 – фракция с ММ ~ 9кДа

Рис. 4. Доля разных фракций при гидролизе РК трипсином: 1 – фракция с ММ выше 17 кДа; 2 – фракция с ММ ~ 17 кДа; 3 – фракция с ММ ~ 9кДа; 4 – олигомерная фракция с ММ ~ 0,3кДа

Таблица 1

Молекулярно-массовые параметры РК при ферментативном гидролизе панкреатином в течение 3 суток

№ п/п	Значения ММХ во время гидролиза
	мин								3 суток
	1		10		60		120
	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n
1	33,1	1,2	24,9	1,1	21	1,0	20,8	1,0	–	–
2	17,5	1,0	17,5	1,0	17,3	1,0	17,5	1,0	17,2	1,0
3	9,2	1,0	8,7	1,0	8,5	1,0	8,7	1,0	8,3	1,0

Таблица 2

№ п/п	Значения ММХ во время гидролиза
	мин								3 суток
	1		10		60		120
	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n	М w ·10–3	М w /М n
1	39,5	1,3	30,7	1,2	22,5	1,0	21,9	1,0	–	–
2	17,4	1,0	17,4	1,0	17,4	1,0	17,4	1,0	17,1	1,0
3	8,6	1,0	8,8	1,0	8,6	1,0	8,7	1,0	8,6	1,0
4	0,3	1,4	0,3	1,5	0,3	1,3	0,3	1,3	–	–

Различия в значениях ММ и соотношении фракций с разной ММ свидетельствуют о влиянии природы ферментов на процесс гидролиза высокомолекулярного коллагена. Представленные результаты хорошо согласуются с известными литературными данными о природе ферментов панкреатина (в его составе протеолитические ферменты трипсин, пепсин и химотрипсин), которые катализируют гидролиз пептидных связей, образованных остатками аминокислот аргинина и лизина [25]:

Н2О панкреатин, тромбин

R-Arg-Lys-R, ------*  R~Arg—ОН + HlvsR,, где R и R1 – аминокислотные последовательности фрагментов коллагена.

Эта ярко выраженная ограниченная субстратная специфичность ферментов приводит к практически количественному образованию (более 80 % от исходного) в процессе гидролиза узкодисперсного (КП~ 1,1) низкомолекулярного полимера с ММ~9 кДа и небольшого количества его димера – олигомера с М w ~ 17–18 кДа (КП~ 1,1). Незначительные различия в значениях ММ первой, более высокомолекулярной в сравнении с олигомерными, фракции в присутствии двух разных ферментов связаны, видимо, с различиями в природе и эффективности, связанной с расположением аминокислот каталитических центров ферментов, что характерно для катализаторов любого происхождения [25].

Заключение

Таким образом, проведен ферментативный гидролиз коллагена, выделенного из покровных тканей трески, в условиях, близких к таковым при формировании скаффолдов, разными ферментами – панкреатином, трипсином. Анализ молекулярно-массовых характеристик гидролизатов коллагена методом гель-проникающей хроматографии в течение трех суток процесса показал, что разрушение белка происходит с образованием двух низкомолекулярных фракций сразу после 1-й минуты гидролиза, ММ которых независимо от природы фермента имеют значения М_w~9 кДа (M w /M n ~ 1,1) (более 80 % в смеси) и М w ~ 17–18 кДа (M w /M n ~ 1,1). Высокая эффективность панкреатина и трипсина приводит к тому, что в растворе сразу после первой минуты отсутствует высокомолекулярная фракция, ферменты разрушают коллаген до фрагментов не более 40 кДа. Однако заметно небольшое различие в характеристиках продуктов гидролиза и их соотношении, что обусловлено природой каталитических центров ферментов. Полученные данные представляют интерес для разработки матриц на основе коллагена в присутствии ферментов разной природы. В совокупности с результатами исследований действия ферментов на другие компоненты конструкции скаффолдов, а также биомиметическими испытаниями они позволят моделировать состав, строение и важнейшие характеристики скаффолдов с оптимизированными свойствами. Это особенно важно, если в процессе формирования скаффолдов и биомедицинских клеточных продуктов используются реакции ферментативного гидролиза и получаемая в результате клеточная матрица формируется не из нативных молекул, а из их гидролизатов.

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Новые материалы и ресурсосберегающие технологии» НИИХ ННГУ.