Эффективность способов выделения миелокариоцитов из костного мозга здоровых лиц и больных множественной миеломой



А.О. Пестрикова, Е.А. Попонина, М.А. Бутолина, Е.С. Фокина, Н.А. Зорина, Е.С. Осипова

ЭФФЕКТИВНОСТЬ СПОСОБОВ ВЫДЕЛЕНИЯ МИЕЛОКАРИОЦИТОВ ИЗ КОСТНОГО МОЗГА ЗДОРОВЫХ ЛИЦ И БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ

ФБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медикобиологического агентства», г. Киров

Введение . Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются важным средством регенеративной медицины, клеточной терапии и тканевой инженерии. Материал для культивирования МСК получают путем фракционирования костного мозга (КМ) с выделением миелокариоцитов (МКЦ). Вопрос выбора метода получения МКЦ в зависимости от особенностей исходного материала недостаточно изучен.

Цель . Сравнить эффективность выделения МКЦ методом центрифугирования в градиенте плотности «Lympholite-Н» и с использованем метилцеллюлозы у здоровых лиц и больных множественной миеломой (ММ).

Материалы и методы. МКЦ выделяли из КМ 45 пациентов с ММ, получавших лечение в ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в период с 2018 по 2021 гг. (возраст от 38 до 80, медиана 57 лет), а также 23 доноров гемопоэтических стволовых клеток с 2018 по 2021 гг. (возраст от 14 до 48, медиана 30 лет). Выделение МКЦ (15 больных ММ; 17 доноров) с использованием «Lympholite-Н» (Cedarline, Канада) осуществляли путем наслаивания на него образца костного мозга в объемном соотношении 2:1 соответственно и последующего центрифугирования при 400 g в течение 20 мин для создания градиента плотности. Далее извлекали средний слой ядерных клеток из градиента. Отмывание клеток от «Lympholite-Н» производили питательной средой «Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium (DMEM)» (StemCells Technologies, Канада) трехкратным центрифугированием и ресуспендированием полученного осадка. Процедура выделения МКЦ (30 больных ММ; 6 доноров) с использованием метилцеллюлозы включала в себя смешивание образца КМ с 0,2% раствором полимера в объемном соотношении 2:1 и последующей седиментацией клеток в течение 1 часа при температуре 20-25 °С. После разделения смеси на 2 слоя, верхний, содержащий фракцию МКЦ, собирали с последующим двукратным отмыванием питательной средой DMEM от остаточных количеств полимера. Подсчет концентрации ядерных клеток в исходном образце и в пробе после выделения МКЦ осуществляли унифицированным методом в камере Горяева. Для оценки эффективности выделения фракции МКЦ рассчитывали процентное соотношение конечного содержания клеток. Культивирование МСК осуществляли в питательной среде αMinimum Essential Medium Eagle (StemCells Technologies, Канада) с добавлением богатой тромбоцитами плазмы (4%), гепарина («Sigma», 2 Ед/мл), L-глутамина 2 мМ («StemCells Technologies»). Культуру МСК инкубировали при температуре 37° С в атмосфере 5% углекислого газа (СО2-инкубатор Sanyo MCO-5AC). На 14 сутки культивирования производили подсчет фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) с использованием инвертированного микроскопа МС-700 (I) Micros. Результаты представлены в виде медианы и квартилей. Для сравнения показателей групп использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, различия считали значимыми при уровне p<0,05.

Результаты . Исходные образцы КМ больных ММ и здоровых лиц отличались по количеству ядросодержащих клеток, клеточ-ность КМ у пациентов была ниже и составила 8,0х106/мл [5,9; 10,9] в сравнении с 19,5х106/мл [11,4; 23,4] у доноров (р<0,05). У здоровых лиц, как на градиенте плотности, так и с применением метилцеллюлозы, получены сопоставимые результаты эффективности выделения МКЦ (49,8% [41,2; 61,5] против 53,0% [43,1; 57,8], р>0,05). У больных ММ процент МКЦ при выделении на «Lympholite-Н» был ниже, чем с использованием полимера (42,7% [28,6; 53,0] против 51,3% [33,6; 69,1], р<0,05). Выделение МКЦ способом седиментации у пациентов с ММ по эффективности сравнимо с результатами здоровых лиц. Колониеобразующая способность клеток после посева фракции МКЦ не зависела от метода их выделения и равнялась 10,95 [6,10; 17,87] на 1х106 МКЦ при использовании «Lympholite-Н», а для культур, полученных из МКЦ с применением метилцеллюлозы, - 8,65 [5,25; 17,72] на 1х106 МКЦ (р>0,05).

Выводы . При сравнении эффективности фракционирования КМ здоровых лиц с применением градиента плотности «Lympholite-Н» и 0,2 % раствора метилцеллюлозы достоверных различий не установлено. У больных ММ предпочтителен седиментационный метод с использованием метилцеллюлозы.