Экологический мониторинг бактериальной загрязненности некоторых водоемов Ставропольского края

На территории Российской Федерации существуют природные очаги особо опасных и других инфекций, в связи с этим необходим контроль бактериальной загрязненности. Одной из устойчивой зоонозной инфекций, имеющей природную очаговость, является туляремия. Характерная особенность эпидемиологии данного возбудителя – множественность механизмов заражения и путей передачи инфекции, почти 100%-ная восприимчивость к ней людей. Природные очаги туляремии характеризуются стойкостью, длительностью существования и могут проявлять активность через много лет относительного благополучия. Возбудитель туляремии обладает высокой экологической пластичностью.

В Ставропольском крае существует обширный и стойкий очаг туляремии, с 1972 по 2004 гг. выделены 363 штамма данного возбудителя. Последний цикл активности очага (2003-2005 гг.) выявил эпидемическую значимость локальных источников водоснабжения – родниковых каптажей.

Источником инфекции явились грызуны, среди которых отмечалась эпизоотия туляремии. В настоящее время на территории РФ выявляют 6 основных ландшафтных типов природных очагов туляремии: лугополевой, степной, пойменноболотный, предгорно- (горно) -ручьевой, лесной, тундровый [1]. Одним из распространенных является водный путь передачи инфекции: заражение людей происходит через контаминированную возбудителем воду ручьев и других открытых водоисточников. Основным источником инфицирования воды являются водяные полевки, ондатры, полевки-экономки. Механизм заражения преимущественно алиментарный, реже – контактный (купание в зараженном источнике, умывание). Исследование объектов внешней среды является эффективным способом обнаружения возбудителя туляремии, так как для него характерна значительная устойчивость во внешней среде.

Пробы воды берут из различных водоемов на глубине 10-20 см от поверхности стоячей или слабо проточной воды. Но концентрация возбудителя туляремии в водных объектах, как правило, ниже чувствительности известных методов диагностики. Традиционно при исследовании проб требуется предварительная фильтрация, центрифугирование. Эти манипуляции чрезвычайно трудоемки, требуют строгого соблюдения режима [2]. В связи с этим целесообразно использование магнитных ловушек с магноиммуносорбентами (МИС), представляющих собой алюмосиликатную магнитную матрицу с иммобилизованными антителами против туляремийного микроба, позволяющих проводить селективное концентрирование возбудителя. В ранее представленной нами работе [2] сообщалось о применении данных МИС для концентрирования возбудителя туляремии в водных объектах внешней среды с последующей постановкой иммуноферментного анализа (ИФА). При исследовании 4 водных объектов (р. Егорлык, левая ветвь Правоегорлыкского канала; проток р. Алибек в бассейне р. Теберда; озеро Мусса-Ачитара, бассейн р. Гоначхир и озеро Доломит в бассейне р.Узункол) в ИФА были получены отрицательные результаты.

На основе разработанных органокремнезёмных МИС сконструированы тест-системы для диагностики возбудителя туляремии не только в ИФА, но и в полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данное сочетание МИС с экспресс-анализами необходимо для повышения чувствительности, достоверности и воспроизводимости результатов, что возможно в связи со способностью МИС селективно фиксировать на своей поверхности исследуемый материал из большого объёма жидкости, проводить эффективную отмывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций [3, 4].

Одним из перспективных методов экспресс-анализа на наличие ДНК патогена в исследуемом объекте на сегодняшний день является полимеразная цепная реакция (ПЦР) [5]. Важнейшим из условий успешного применения этого метода в диагностике инфекционных заболеваний является наличие эффективных способов подготовки тестируемых в ПЦР проб. ПЦР исследования проводят в соответствии с методическими указаниями [6] и инструкцией к данной тест-системе. Постановка ПЦР включает 3 стадии: пробоподготовку, непосредственно амплификацию и учет результатов (электрофорез). Необходимым условием, значительно повышающим эффективность детекции ДНК в ПЦР при низких концентрациях возбудителя туляремии (1х102; 1х103 мк/мл), является применение мультиплексной ПЦР тест-системы с эффективной амплификацией специфических ДНК-мишеней. Для обнаружения специфического фрагмента ДНК F. Tularensis была использована мультиплексная ПЦР тест-система, разработанная в ФГУЗ Став-НИПЧИ с праймерами комплиментарными участкам мобильного элемента ISFtu2 и генов 23 кDa, fopA. Применение этой тест-системы позволяет помимо детекции ДНК возбудителя туляремии определять ориентировочную концентрацию возбудителя за счет различной эффективности амплификации выбранных ДНК-мишеней. При исследовании проб из десятикратных разведений чистой культуры F.tularensis holarctica «15 НИИЭГ» с концентрацией (1х105, 1х104, 1х103 мк/мл) на электрофореграмме отчетливо регистрировались все три ампликона ISFtu2 (208 п.н.), 23 кDa (349 п.н.) и fopA (500 п.н.). При снижении концентрации возбудителя в пробе и соответственно ДНК в амплификационной смеси от 1х103 до 1х101 мк/мл на электрофореграмме первой исчезает полоса фрагмента fopA (500 п.н.), затем 23 кDa (349 п.н.) и последней ISFtu2 (208 п.н.). Эффективная амплификация фрагмента ISFtu2 объясняется мультикопийностью данного фрагмента в геноме F.tularensis и преимуществом синтеза в мультипраймерной смеси более коротких ампликонов. Присутствие любого из фрагментов и их сочетаний в пробе и располагающихся строго на уровне положительного контроля интерпретируется как положительный результат. При использовании в качестве проб чистых культур бактерий особых трудностей в подготовке образцов для постановки ПЦР не возникает [7]. Более трудной задачей представляется обработка проб объектов внешней среды (вода открытых водоемов, гнезда грызунов и т.д.), так как в этом случае необходимо использовать особые приемы, позволяющие избавиться от посторонних примесей и максимально сконцентрировать искомую ДНК. Примеси, находящиеся в объектах внешней среды являются ингибиторами ПЦР, способны значительно снижать чувствительность реакции за счет угнетения активности термостабильной ДНК-полимеразы, входящей в состав реакционной смеси [8].

Для устранения этих негативных явлений мы объединили два метода: избирательное концентрирование возбудителя туляремии на МИС с последующей постановкой полимеразной цепной реакции. Эксперименты проводили с чистой культурой – вакцинным штаммом туляремийного микроба «15 НИИЭГ», в модельных опытах на воде с садовой почвой (100:1), контаминированной туляремийным микробом с концентрациями 101; 1х102; 1х103; 1х104; 1х105 мк/мл. Для модельного опыта собирали систему, состоящую из стеклянных трубок и постоянного магнита. МИС помещали в проточную трубку с фиксацией на постоянном магните, через которую пропускали 3 литра контаминированной воды. При этих условиях достигалось максимальное концентрирование антигена на поверхности МИС за счет реакции «антиген-антитело». В дальнейшем МИС извлекали и помещали во флакон, промывали физиологическим раствором, тем самым обеспечивая отмывание МИС от посторонних примесей, контаминирующей микрофлоры и исследовали в ПЦР.

МИС после контакта с F. tularensis суспендировали в 0,1 мл деионизированной воды и далее проводили пробоподготовку [6]. Аликвоту в 10 мкл исследовали в ПЦР. Положительными кон-тролями служили образцы выделенной ДНК F. tularensis. Амплификацию проводили на амплифи-каторе Терциктм МС 2 (ЗАО “ДНК-технология”, Россия). Продукты амплификации анализировали методом электрофореза в 1,5-2% агарозном геле с последующим окрашивание бромистым этидием, визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете и документированием на системе EDAS-120. Параллельно все исследуемые пробы подвергали ПЦР-анализу без предварительного концентрирования патогена на магноиммуносорбенте. Положительные результаты ПЦР были получены при концентрации возбудителя 1х102 мк/мл и выше при обычной и сочетанной с концентрированием на МИС пробоподготовкой (при работе с чистыми культурами туляремийного микроба). В модельных опытах (вода с почвой, контаминированные возбудителем туляремии) выявлено преимущество использования МИС в пробоподготовке, что позволило выявить ДНК возбудителя при его концентрации 1х102 мк/мл. Обычное выделение ДНК было эффективно лишь при концентрации возбудителя в пробе 1х104 мк/мл. При исследовании 4 проб, контактировавших с антителами туляремийными на МИС, из водных объектов (р. Егорлык, левая ветвь Правоегорлыкского канала; проток р. Алибек в бассейне р. Теберда; озеро Мусса-Ачитара, бассейн р. Гоначхир и озеро Доломит в бассейне р. Узункол) в ПЦР получены отрицательные результаты, что подтвердило предыдущие результаты в ИФА. Использование МИС в ПЦР позволило максимально сконцентрировать микробные клетки и исключить отрицательное влияние на компоненты реакции ингибиторов. Мультиплексный формат тест-системы повышает надежность ответа в случаях, когда выделить живую культуру невозможно.

Выводы: нами сконструированы магноим-муносорбенты на основе магнитной матрицы, испытания диагностической ценности которых в лабораторных и модельных условиях показали возможность их эффективного использования при исследовании объектов внешней среды (детекции возбудителя туляремии) в сочетанных экспрессных анализах – ИФА, ПЦР.