Экспериментальная коррекция коллагеногенеза при использовании герниопротезов

Вентральные грыжи передней брюшной стенки являются актуальной проблемой современной гернио-логии. До 26,8% выполняемых операций приходится на вентральные грыжи [3, 7]. Используемые при герниопла-стике эндопротезы могут вызывать в области импланта воспалительную реакцию, реакцию отторжения материала, образование сером, нагноение. Все это ухудшает и препятствует нормальному синтезу соединительной ткани [4, 5, 12, 14].

Известно, что в развитии вентральных грыж важнейшую роль играет нарушение коллагенового обмена, которое в свою очередь приводит к дисгенезу зрелой соединительной ткани. По мнению ряда авторов нарушение коллагенового обмена является причиной возникновения грыж передней брюшной стенки [2, 4, 9, 11]. Различают множество видов коллагена. Особое значение следует выделить коллагену I и III типов, участвующих в формировании соединительной ткани и влияющих на прочность передней брюшной стенки. Изменение соотношения типов коллагена, в подавляющем случае, ведет к образованию грыж передней брюшной стенки, т.к. происходит снижение прочности и нарушение структуры апоневроза

[8, 10, 13]. Созревание соединительной ткани в месте пластики можно ускорить препаратами, улучшающими метаболизм в тканях, и стимуляторами регенерации. Одними из таких препаратов являются «Оротат калия» и «Аскорбиновая кислота», активизирующие репаративные и метаболические процессы в тканях [1, 6, 14].

Использование фармакологических препаратов, оптимизирующих синтез коллагена при эндопротезировании вентральных грыж, представляет особый интерес для улучшения процессов организации соединительной ткани в области эндопротеза.

Цель: сравнить динамику синтеза коллагеновых волокон в парапротезной капсуле в области эндопротеза «Parietene ProGrip» на фоне использования препаратов «Оротат калия» и «Аскорбиновая кислота» в эксперименте.

Материалы и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 146 особях половозрелых белых мышей. Все животные проходили карантин в условиях НИИ экологической

медицины Курского государственного медицинского университета. Распределение животных по экспериментальным группам представлено в табл. 1.

Всем животным в стерильных условиях под эфирным наркозом выполняли разрез кожи на передней брюшной стенки и формировали карман. Далее имплантировали эндопротез «Parietene ProGrip» размерами 0,5 х 0,5 см на мышцы передней брюшной стенки, имитируя пластику «OnLay». Фиксация эндопротеза не производилась. Животным 2-й группы в пищевой рацион добавлялся препарат «Оротат калия» из расчета 0,5 мг на одно животное в сутки; животным 3-й группы в корм добавляли аскорбиновую кислоту из расчета 0,2 мл на одно животное в сутки.

Parietene™ ProGrip (Производство Covidien Sofradim, Франция) представляет собой полурассасывающуюся самофиксирующуюся композиционную сетку, которая состоит из 50% полипропилена и 50% рассасывающейся полимолочной кислоты, которые образуют микрокрючки, обуславливающие эффект самофиксации. Масса сетки до рассасывания полимолочной кислоты 80 г/м2. После рассасывания – 40 г/м2, средний размер пор – 1,7 мм.

Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 30, 60, 90 сутки.

Для получения макропрепарата брали участки передней брюшной стенки с частью эндопротеза размерами 1,0 х 1,0 см и помещали в 10% раствор формалина. В дальнейшем препараты заливали в парафиновые блоки, делали срезы 6-7 мкм и окрашивали пикросириусом красным (Sirius Red).

Полученные стекла исследовались при помощи поляризационного микроскопа Altami Polar 2. Соотношение типов коллагена оценивали в программе ImageJ Pro по цветовой гистограмме.

В области капсулы эндопротеза производили оценку типов коллагена. Определение соотношения типов коллагена оценивали по цветовой гамме, характеризующей каждый тип и его переходную форму. Так, красный цвет соответствует коллагену I типа, зеленый – III тип. Высчитывались абсолютные значения красного и зеленого цветов спектра с помощью визуально-программных комплексов. В дальнейшем абсолютные величины переводились в относительные с использованием стандартного отклонения и рассчитывали коэффициент соотношения коллагена I типа к III.

Статистическую обработку выполняли с помощью приложения Microsoft Excel-2013, Statistica 6.0. Вычисляли средние величины количественных показателей (М), стандартное отклонение (m), коэффициент Стьюдента.

Результаты исследования

Для определения степени зрелости и коллагенового состава парапротезной капсулы необходимо изучение соотношения типов коллагена. Для изучения степени зрелости соединительнотканной парапротезной капсулы необходимо сравнение процентного содержания коллагенов I и III типов.

Табл. 1. Распределение лабораторных животных по группам эксперимента

Группы	Количество животных/сутки
	7	10	30	60	90
1 – Parietene ProGrip	10	8	9	10	10	47
2 – Parietene ProGrip + ОК	10	10	9	10	10	49
3 – Parietene ProGrip + вит. С	10	10	10	10	10	50
Всего						146

При экспериментальном исследовании соотношения типов коллагена в соединительнотканной капсуле нами выявлены достоверные отличия в зависимости от использования фармакологических препаратов и сроками наблюдения.

При оценке соотношения коллагена I и III типов в парапротезной капсуле, ее структуры, динамики коллаге-ногенеза в группах эксперимента 1, 2, 3 на 7-е, 10-е сутки достоверных отличий получено не было (р > 0,05). Данное явление объясняется коротким временным интервалом и переходом фазы альтерации в пролиферацию. Следует отметить, что капсула во всех исследуемых группах тонкая, имеющая участки черного цвета. Это свидетельствует об отсутствии плотной волокнистой ткани в своей структуре. В видимой части капсулы визуализируется цветовая гамма зеленого спектра, что характерно для незрелой соединительной ткани. Относительное содержание коллагена I типа на 10-е сутки в 1-й группе животных (без использования препаратов) составило 49,02 ± 1,37%. При использовании оротата калия и аскорбиновой кислоты в группах эксперимента 2 и 3, соответственно, достоверных отличий (р > 0,05) по процентному содержанию коллагена I типа не получено (51,13 ± 1,41% и 50,11 ± 1,69%). Соотношение коллагена I и III типов в 1-й группе составило 0,96, во 2-й группе – 1,04, в 3-й группе – 0,94 (табл. 2).

При поляризационной микроскопии препаратов, полученных на 30-е сутки эксперимента при использовании препарата «Оротат калия», соотношение типов коллагена достоверно больше (р ≤ 0,05) по сравнению с 1-й группой и составило 1,92 и 1,36, соответственно. Па-рапротезная капсула, на данном сроке сформированная, имеет плотное строение, выполнена преимущественно плотной волокнистой соединительной тканью. Следует отметить преобладание тонов красного цвета в капсуле, характеризующее явное превалирование коллагена I типа над III типом в сравнении с предыдущими сроками.

Парапротезная капсула при использовании препарата «Аскорбиновая кислота» на 30-е сутки эксперимента выполнена преимущественно плотной волокнистой соединительной тканью, состоящей из коллагена I типа. Соотношение типов коллагена составило 1,97, что в 1,44 раза выше по сравнению с 1-й группой животных. Однако, достоверных отличий (р > 0,05) по соотношению типов коллагена в 2-й и 3-й группах нами не выявлено (соотношение типов коллагена во 2-й группе – 1,92, в 3-й – 1,97).

При исследовании гистологических препаратов на 60-е сутки эксперимента соотношение типов коллагена в парапротезной капсуле при использовании аскорбиновой кислоты составило 3,03, что достоверно больше (р ≤ 0,05) в сравнении с 1-й группой животных (1,96). В случае с применение оротата калия данное соотношение составило 2,94, что 1,5 раза больше по сравнению с группой животных, препараты которым в кормовой рацион не вводились. Из вышесказанного следует, что применение препаратов в группах животных 2 и 3 достоверно повышает показатели соотношения типов коллагена в околопротезных тканях. Данное обстоятельство свидетельствует об ускорении созревания коллагеновых фибрилл и их структурной организации. Следует отметить, что в группе животных, в кормовой рацион которых добавлялся оротат калия, капсула в своей структуре имеет меньшее количество «рыхлых» участков в сравнении с 1-й и 3-й группами исследования. Это объясняется непосредственным действием препарата «Оротат калия» на формирование поперечных водородных связей между коллагеновыми фибриллами, что особо важно для формирования прочного послеоперационного рубца.

К 90-м суткам эксперимента при поляризационной микроскопии гистологических препаратов отмечаются максимальные относительные значения коллагена I типа в сравнении с предыдущими сроками. В 1-й группе эксперимента на I тип коллагена приходится 69,83 ± 1,26%, во 2-й группе – 77,49 ± 0,87%, в 3-й группе – 79,01 ± 0,95%. Следует отметить продолжающуюся тенденцию воздействия препаратов на модификацию процесса синтеза коллагена, заключающегося в достоверно больших (р ≤ 0,05) показателях соотношения типов коллагена по сравнению с предыдущими сроками (табл. 2). Однако, соотношения типов коллагена во 2-й (3,44) и 3-й (3,76) группах достоверных отличий на одинаковых сроках не имеют (р > 0,05).

Следует обратить внимание на наличие «рыхлых» участков в парапротезной капсуле (рис. 1).

Табл. 2. Соотношение коллагена I типа к III типу в области имплантации в зависимости от применения препаратов «Оротат калия» и «Аскорбиновая кислота»

Сутки Группы животных	10 сут.	30 сут.	60 сут.	90 сут.
1-я группа (Parietene ProGrip)	10 сут.	30 сут.	60 сут.	90 сут.
I тип коллагена (%)	49,02	57,63#	66,27#	69,83#
III тип коллагена (%)	50,98	42,37#	33,73#	30,17#
m (стандартное отклонение)	±1,37	±1,17	±1,34	±1,26
Соотношение I /III ТК	0,96	1,36#	1,96#	2,31#
2-я группа (ParieteneProCrip+ОК)	10 сут.	30 сут.	60 сут.	90 сут.
I тип коллагена (%)	51,13	65,82*#	74,68*#	77,49*#
III тип коллагена (%)	48,87	34,18*#	25,32*#	22,51*#
m (стандартное отклонение)	±1,41	±1,21	±1,29	±0,87
Соотношение I /III ТК	1,04	1,92*#	2,94*#	3,44*#
3-я группа (ParieteneProGrip+вит С)	10 сут.	30 сут.	60 сут.	90 сут.
I тип коллагена (%)	50,11	66,35*#	75,2*#	79,01*#
III тип коллагена (%)	49,89	33,65*#	24,8*#	20,99*#
m (стандартное отклонение)	±1,69	±1,24	±1,27	±0,95
Соотношение I /III ТК	0,94	1,97*#	3,03*#	3,76*#

Примечание : * – p ≤ 0,05, сравнение показателей типов коллагена 2-й и 3-й групп с 1-й группой на одинаковых сроках. # – p ≤ 0,05 сравнение показателей типов коллагена между смежными сроками.

В группах животных, которым в кормовой рацион добавлялись препараты, отмечается меньшее количество дефектов и их размеры в сравнении с 1-й группой исследования. При сравнении структурных особенностей парапро-тезной капсулы 2-й и 3-й групп животных, можно говорить о лучшем течении процесса организации соединительной ткани в случае с применением препарата «Оротат калия», так как в структуре капсулы отмечается меньшее количество «рыхлых» участков. Исходя из этого, отмечается лучший эффект оротата калия на процесс синтеза коллагеновых волокон и их структурную организацию.

Рис. 1. Микроскопическая картина зоны имплантации протеза «Parietene ProGrip», 90-е сут. А – без применения препаратов; Б – с применением препарата «Оротат калия»; В – с применением препарата «Аскорбиновая кислота». Стрелками указаны «рыхлые» участки в парапротезной капсуле. Поляризационная микроскопия. Окраска Sirius Red. Ув. х 400

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований, нами выявлено стимулирующее действие оротата калия и аскорбиновой кислоты на синтез коллагена после имплантации эндопротеза. К 90-м суткам соотношение коллагена I типа к III типу на фоне применения аскорбиновой кислоты составило 3,76, что в 1,62 раза больше по сравнению с 1-й группой животных. В случае с применением оротата калия данное соотношение составило 3,44, что достоверно больше (р ≤ 0,05), чем в группе животных без применения препарата (2,31). Однако, достоверных отличий по соотношению типов коллагена между группами животных с использованием фармакологических препаратов на протяжении всего эксперимента не получено, что объясняет их равное действие на динамику созревания парапротезной капсулы.