Экспериментальная модель для изучения процессов репаративного остеогенеза

Одним из актуальных вопросов травматологии и ортопедии является тестирование различных способов и средств в экспериментальных условиях, которое требует адекватной модели репаративного остеогенеза. Нами была предложена модель перелома реберной кости у лабораторных мышей. В доступной литературе нам не удалось найти описания такой операции, хотя работы на подобной модели цитируются [24]. Цель работы: характеристика протекания репаративного остеогенеза при моделировании перелома тела реберной кости у лабораторных мышей, а также динамики изменения биохимических, гематологических и иммунологических показателей.

Материал и методы

В опытах был исследован материал от 464 белых мышей-самцов линии СВА массой 25–30 г. Уход за животными, эксперименты и эвтаназию проводили в соответствии с этическими нормами работы с лабораторными животными, отраженными в Правилах проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ №755 Министерства здравоохранения СССР от 12

августа 1977 г.).

Выполнение операции по моделированию перелома реберной кости у мышей. Перелом реберной кости у мышей осуществляли под общим наркозом. Для этого подкожно в область шеи инъецировали по 0,04 мл каждого из препаратов Рометар и Золетил после их разведения стерильной дистиллированной водой в 3 и 15 раз соответственно. Готовили операционное поле в зоне интереса размером 1,5 см х 1,5 см, проводили разрез кожного покрова длиной около 0,8 см по линии позвоночного столба, после чего на расстоянии 3–4 мм от последнего перерезали 4-е ребро. Операционную рану ушивали узловыми швами шелком и обрабатывали клеем БФ-6.

Исследования биологического материала. Морфологические исследования выполняли на биологических образцах фрагментов реберных костей, извлеченных после эвтаназии животных через 10 и 30 суток после операции; количество животных (n) – от 8 до 10 в каждой группе. Образцы фиксировали в 10-процентном растворе формалина, обезжиривали в ацетоне, декальцинировали в Трилоне Б, обезвоживали и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5–7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование гистологических препаратов проводили на микроскопе

“Микмед 5” (“ЛОМО”, Россия). Для выполнения гистомор-фометрического исследования на проекционном экране микроскопа Visopan (“Reichert-Jung”, Австрия) размещали тестовую систему в виде решетки с ячеями известной площади. В произвольно выбранных неперекрыва-ющихся полях зрения производили подсчет количества дифференцированных клеток хондробластического и ос-теобластического ряда в периосте, а также числа микрососудов в параоссальной области. Через 1, 3, 5 и 7 суток после операции (п=7 ^ 10) проводили гематологические исследования, включавшие подсчет количества лейкоцитов, эритроцитов в единице объема, лейкоцитарной формулы, ретикулоцитов в периферической крови. Иммунологические исследования (п=6 ^ 10) проводили спустя 1, 3 и 7 суток после операции. Они заключались в определении бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК) по методике С.А. Паевского в модификации [16, 20], лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) [22], фагоцитарной активности нейтрофилов по поглощению микробных клеток Staphylococcus epidermidis (штамм №9198 НИИЭМ) с подсчетом фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа [11]. Биохимические исследования сыворотки крови, проводимые спустя 3 и 10 суток после операции (п=6 ^ 21), включали спектрофотометрическое определение в сыворотке крови активности щелочной (ЩФ) и тартратрезистентной кислой фосфатаз (ТрКФ), содержания кальция, магния, фосфора и хлоридов, молочной кислоты (МК) с помощью наборов Vital Diagnostic (СПб), пировиноградной кислоты (ПВК) по методу Умбрайта [2]. Для всех перечисленных показателей были определены их величины у интактных животных, принятые в качестве контрольных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вилкок-сона для независимых выборок. Критический уровень гипертрофированы, в части клеток отмечались дегенеративные изменения (рис. 1Б на 3-й стр. обложки). Новообразованная костная ткань наблюдалась в виде тонкого слоя непосредственно на поверхности компактной пластинки кости (рис. 1В на 3-й стр. обложки), реже – в виде перихондрально образованных костных трабекул. К 30-м суткам после операции было сформировано периостальное костно-хрящевое и эндостальное костно-волокнисто-соединительнотканно-хрящевое сращение перелома. Компактная костная пластинка отломков реберной кости была спонгизирована (рис. 2А на 3-й стр. обложки). Объемные периостальные наслоения были представлены губчатой костной тканью с сетью пластинчатых трабекул и красным костным мозгом межтрабекулярных пространств (рис. 2Б на 3-й стр. обложки). В плоскости перелома сохранялись очажки гиалинового хряща (рис. 2В на 3-й стр. обложки) и поля рыхлой волокнистой соединительной ткани (рис. 2Г на 3-й стр. обложки), формировались периостальные костные перемычки. Численная плотность клеток опорных тканей для обоих сроков эксперимента представлена в таблице 1.

Общее количество лейкоцитов периферической крови в сроки эксперимента достоверно не изменялось. Статистически значимо на всех сроках опыта снижалось количество нейтрофильных лейкоцитов за счет палочкоядерных и сегментоядерных с восстановлением количества последних на 7-е сутки опыта (рис. 3). С 1-х суток после операции снижалось содержание моноцитов, также оставаясь низким спустя 7 суток после операции. Единственным видом лейкоцитов, количество которых не снижалось, остались лимфоциты; их относительное содержание на 1, 3 и 5-е сутки эксперимента было даже выше дооперационных значений.

Среди изученных показателей неспецифической резистентности единственным достоверно изменявшимся значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты и обсуждение

На гистологических препаратах исследовали фрагменты тел реберных костей, включающие зону сращения перелома и прилежащие участки костных отломков. Спустя 10 суток после операции в интермеди-арной части зоны сращения перелома располагалась рыхлая, реактивно измененная волокнистая соединительная ткань, бесструктурные массы детрита. В периостальной части зоны сращения формировалась объемная костно-хрящевая мозоль (рис. 1А на 3-й стр. обложки). Хрящевая ткань отличалась высокой клеточной плотностью. Поверхностно расположенные хондроциты имели меньший диаметр и входили в состав изогенных групп, тогда как глубоко расположенные хондроциты были

Рис. 3. Гематологические показатели периферической крови животных, % от контрольных значений. Приведены медианы показателей, имеющие в динамике наблюдений достоверные отличия от контрольных (* – р<0,05). По оси абсцисс – сутки после операции. Обозначения: Hb – гемоглобин (г/л), Р – ретикулоциты (х 109/л), ПФ – палочкоядерные нейтрофилы (х 109/л), СФ – сегментоядерные нейтрофилы (х 109/л), НФ – нейтрофилы (х 109/л), ЛЦ – лимфоциты (%), МЦ – моноциты (%)

Таблица 1

Количество клеток и микрососудов на единицу площади периоста/параоссальной ткани (0,0025 мм2)

	Срок опыта*	Костные клетки	Хрящевые клетки	Микрососуды
Медиана		0,600	6,40	0,163
1 квартиль	10 суток	0,529	5,90	0,140
3 квартиль		0,921	7,39	0,173
Медиана		4,04	1,70	0,088
1 квартиль	30 суток	3,90	1,49	0,075
3 квартиль		4,33	2,47	0,119
p-значение		0,005	0,005	0,035

Примечание: * – для обеих точек опыта, объемы выборки n=6.

была лизоцимная активность сыворотки крови (табл. 2), которая оставалась ниже значений интактных животных на всех сроках опыта.

Концентрации электролитов (кальция, хлорида, фосфора, магния) в сроки эксперимента не отличались от контрольных значений. Активность ЩФ в два раза возра- стала, а ТрКФ снижалась в полтора раза на 10-е сутки после операции (табл. 3). Концентрация МК к этому сроку опыта также снижалась. Содержание ПВК повышалось к 3-м, после чего снижалось к 10-м суткам после операции.

Обсуждение

В литературе имеются исследования, оценивающие репаративные способности реберной кости как промежуточные между таковыми у большеберцовой и бедренной кости [13]. Гистологические исследования подтвердили адекватность выбора именно этой кости для моделирования перелома. Анатомические особенности ее расположения оказались благоприятными как для получения воспроизводимой морфологической картины периостального регенерата, так и для количественной оценки интенсивности регенераторного процесса. К 10-м суткам после операции периостальный регенерат представлен исключительно грубоволокнистой костной и гиалиновой хрящевой тканями, не подвергается резорбции и сосудистой инвазии. Подсчет численной плотности дифференцированных клеточных элементов остео-бластического и хондробластического ряда и микрососудов пароссальных тканей позволяет выявить влияние различных факторов на процессы остео-, хондро- и ангиогенеза.

Хорошо изученные основные принципы регенерации тканей при переломе остаются справедливыми и для данной модели, однако мы обнаружили ряд особенностей в реакции некоторых систем. Деструкция клеток и тканей при переломе вызывает последовательно протекающие защитно-приспособительные процессы, начальными из которых являются реакции воспаления [4, 8, 17]. В первые 6–24 ч в очаг воспаления эмигрируют нейтрофилы, через 24–48 ч – моноциты и лимфоциты. Острые воспалительные процессы с травмой опорно-двигательного аппарата, к числу которых принадлежит и приведенная

Таблица 2

Показатели неспецифической резистентности экспериментальных животных

Показатели*	Срок после операции, сут	n**	Медиана	Квартиль 1	Квартиль 3	р***
БАСК, мм	Интактные	9	18,5	17,00	19,00	-
ЛАСК, %	животные	9	81,90	80,8	83,4	-
БАСК, мм	1	7	18,00	18,00	18,00	0,611
ЛАСК, %	1	7	74,90	70,40	77,00	0,001
БАСК, мм	3	6	16,00	15,25	16,00	0,066
ЛАСК, %	3	6	70,95	66,53	73,05	0,002
БАСК, мм	5	6	18,00	17,25	19,50	0,952
ЛАСК, %	5	6	77,95	75,50	79,88	0,021
БАСК, мм	7	6	18,00	18,00	18,75	0,620
ЛАСК, %	7	6	66,55	65,38	69,30	0,002