Экспериментальная модель остеоартроза коленного сустава у крыс на фоне внутрисуставного введения обогащенной тромбоцитами аутологичной плазмы

Деформирующий остеоартроз – гетерогенная группа заболеваний суставов различной этиологии, но с идентичными биологическими, морфологическими и клиническими признаками и исходом, связанным с потерей гиалинового хряща и сопутствующим поражением других анатомических структур и тканей сустава (субхондральная кость, синовиальная оболочка, связки, капсула сустава, околосуставные сухожилия и мышцы).

Гиалиновый хрящ содержит относительно небольшое количество клеток, окруженных большим количеством межклеточного матрикса. Хондроциты участвуют в регуляции синтеза и деградации компонентов хрящевого матрикса, причем в норме эти процессы находятся в равновесии [5].

Под воздействием множества факторов баланс процессов деградации и репарации нарушается, что впоследствии обуславливает развитие остеоартроза, проявляющегося дегенеративно-дистрофическими изменениями в структуре гиалинового хряща и субхондральной кости, воспалением в окружающих мягких тканях, нарушением физико-химических свойств синовиальной жидкости [5, 9].

Возможность управления биологическим потенциалом собственного организма и использования его в лечебном процессе представляется весьма перспективным и уже находит подтверждение в ряде работ, посвященных обогащенной тромбоцитами плазме (ОТП). Содержание в ОТП большого количества факторов роста, которые могут одномоментно или постепенно выделяться в окружающие ткани, предполагает возможность воздействия на течение воспалительного процесса в суставе и ремоделирование гиалинового хряща [2, 9]. Существующие экспериментальные исследования на этот счет остаются дискутабельными и пока не позволяют составить целостное представление о патоморфозе структурных изменений хрящевой ткани после применения ОТП на фоне остеоартроза [4, 7, 8].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценить морфологические изменения в структуре гиалинового хряща коленного сустава при экспериментальном остеоартрозе после внутрисуставного введения ОТП.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для экспериментального исследования послужили 30 половозрелых крыс линии Wistar массой (250 ± 2,2) г.

При работе с лабораторными животными соблюдали требования, изложенные в правилах лабораторной практики (GLP), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985), приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики», Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977.

Лабораторные животные были распределены на 3 группы по 10 животных в каждой (2 экспериментальные и 1 контрольная). Все манипуляции у животных 3 групп были выполнены под общим обезболиванием с использованием препарата «Рометар» по методике, описанной фирмой-производителем.

В двух экспериментальных группах моделировали остеоартроз путем внутрисуставного введения 10%-й суспензии стерильного талька [1].

Через 30 дней после моделирования остеоартроза животным экспериментальной группы № 2 проводили двухкратное внутрисуставное введение 0,2 мл ОТП с периодичностью 1 раз в 21 день [9].

Животным контрольной группы проводили однократное внутрисуставное введение 0,2 мл 0,9%-го раствора NaCl.

Все внутрисуставные инъекции осуществляли из стандартного передневнутреннего доступа в левый коленный сустав (табл. 1).

Таблица 1

Порода животных			Линия Wistar
Возраст животных			Половозрелые
Масса животных			250 ± 2,2 г
Вводимый препарат Группы	0,9%-й раствор NaCl	10%-я суспензия стерильного талька		ОТП	ГК
Контрольная	0,2 мл однократно	–		–	–
Экспериментальная № 1	–	0,5 мл однократно		–	–
Экспериментальная № 2	–	0,5 мл однократно		0,2 мл 1 раз в неделю, трехкратно, спустя 30 дней после введения талька	–
Все препараты вводили в левый коленный сустав

Характеристика экспериментальных групп животных

Через 1 месяц после проведения внутрисуставных инъекций животных выводили из эксперимента путем введения летальной дозы рометара, вычленяли левую бедренную кость для последующего морфологического исследования.

Хрящевую ткань с субхондральной костью фиксировали в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4) в течение 24 часов (Newell K. J., et al., 2001). Проводили бескислотную декальцинацию в растворе этилендиаминтетраацетате натрия стандартной концентрации. После полного удаления из костной ткани минерального компонента выполняли стандартную гистологическую проводку по спиртам возрастающих концентраций и препараты заключали в парафин, после чего изготовляли срезы толщиной 6–8 микрон, окрашивали гематоксилином и эозином по Маллори (Киясов А. П., 2001; Коржевский Д. Э., 2005).

Фотопротоколирование микроскопических изменений производили с использованием комплекса, включающего микроскоп «Axio Scope» (Carl Zeiss, Германия) и цифровую фотокамеру «Power Shot» (Canon, Япония).

Морфометрический анализ осуществляли с помощью компьютерной программы «Видео ТестМорфо-4» (Россия). Для оценки морфологических показателей определяли толщину суставного хряща (L, мкм) и объемную долю хондроцитов по отношению к матриксу (ОД, %).

Результаты экспериментов обрабатывали методами базисного статистического анализа с использованием программ «Видео Тест-Морфо-4» (Microsoft, США) и «STATISTICA 6.0» (Stat Soft Inc., США).

Анализ параметров при нормальном распределении значений проводили с помощью критерия Стьюдента, анализ непараметрических количественных признаков – с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использовали критерии χ2 и Фишера. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки не превышала р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что в контрольной группе животных суставной гиалиновый хрящ имел толщину (330 ± 17,3) мкм и характерное гистологическое строение. Поверхностные хондроциты характеризовались уплощенной формой и располагались поодиночке в хрящевом матриксе. Хондроциты переходной и базальной зон имели округлую форму и располагались в составе изогенных групп рядами, ориентированными перпендикулярно к суставной поверхности. Объемная доля хондроцитов составляла (13,7 ± 1,1) % (табл. 2). Морфологические признаки дегенеративнодистрофических процессов не визуализировались (рис. 1 а). Иммунохимическая реакция по Маллори выявляла равномерное расположение коллагеновых волокон, отсутствие очагов оссификации (рис. 2 а).

После моделирования остеоартроза происходило уменьшение толщины суставного хряща до (121 ± 20,4) мкм (р < 0,05) и снижение объемной доли хондроцитов до (1,2 ± 0,6) % (р < 0,05). Во всех зонах были отмечены множественные «пустые лакуны» и хондроциты с кариопикнозом, обширные участки деструкции суставной поверхности с разрастанием соединительной ткани, в толще которой определялось гранулематозное воспаление с выраженной гистиомакрофагальной инфильтрацией и гигантскими многоядерными клетками типа инородных тел, полнокровием кровеносных сосудов и неравномерным отеком межклеточного вещества (рис. 1 б).

При гистохимическом исследовании в суставном хряще отмечали неравномерность окрашивания коллагеновых волокон с выраженным нарушением тинкториальных свойств матрикса хрящевой ткани. В участках склероза волокна коллагена были окрашены наиболее интенсивно (рис. 2 б).

После введения ОТП на фоне экспериментального остеоартроза морфометрически было установлено увеличение толщины суставного хряща до (275 ± 18,9) мкм (р < 0,05) и объемной доли хондроцитов до (18,4 ± 2,0) % (р < 0,05).

Различали три отграниченные друг от друга зоны с типичными для остеоатроза дегенеративными изменениями, но выраженными в меньшей степени. В поверхностной зоне контуры суставной поверхности выглядели ровными.

Несмотря на наличие «пустых» лакун и хондроцитов с признаками распада и образованием апоптозных телец, определяли увеличение количества как отдельно расположенных хондроцитов, так и их изогенных групп во всех зонах (рис. 1 в).

В промежуточной зоне происходила очаговая оссификация межклеточного вещества, что было особенно заметно при окраске по Маллори. Равномерность распределения коллагеновых волокон и тинкториальные свойства хрящевого матрикса сохранялись во всех зонах (рис. 2 в).

б

Рис. 1. Различная степень выраженности дегенеративно-дистрофических изменений суставного гиалинового хряща у крыс экспериментальных групп.

Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение ×200:

а – контрольная группа;

б – экспериментальная группа № 1;

в – экспериментальная группа № 2

в

Таблица 2

Экспериментальные группы	Толщина, мкм	Объемная доля хондроцитов, %
Контрольная	330 ± 17,3	13,7 ± 1,1
Экспериментальная № 1	121 ± 20,4*	1,2 ± 0,6*
Экспериментальная № 2	275 ± 18,9**	18,4 ± 2,0**

* Достоверные изменения по отношению контрольной группы (р < 0,05);

** достоверные изменения по отношению к группе с остеоартрозом (р < 0,05).

Морфометрические параметры суставного гиалинового хряща у животных экспериментальных групп

а

б

в

Возникновение и прогрессирование гонарт-роза обусловлено структурными изменениями в суставном хряще и других тканях коленного сустава.

В нормальном суставном хряще процессы деструкции и репарации тканей происходят достаточно медленно, строго контролируются, находятся в равновесии и являются основой физиологического ремоделирования [5].

На сегодняшний день в клинической практике предпринимаются разносторонние попытки воздействия на течение воспалительного процесса в суставе и дегенеративно-дистрофических изменений в гиалиновом хряще.

Роль тромбоцитов в патогенезе остеоартроза, по всей видимости, более многогранна, чем мы сегодня это представляем. Тромбоциты содержат большое количество

Рис. 2. Изменения тинкториальных свойств матрикса хрящевой ткани у крыс экспериментальных групп.

Окраска по Маллори.

Увеличение х400:

а – контрольная группа;

б – экспериментальная группа № 1;

в – экспериментальная группа № 2

быстро высвобождаемых веществ, которые участвуют в первой фазе воспаления, влияя на течение воспалительного процесса в суставе, модулируя его длительность и активность. Кровяные пластинки активируют процессы миграции и активации лейкоцитов, а также репарацию в тканях, что определяет перспективу широкого применения содержащих их лекарственных форм в клинической практике.

Высокий уровень бета-тромбоглобулина, тромбоцитарного фактора 4 в ОТП стимулирует воспалительный ответ, активируя миграцию нейтрофилов. В тоже время ОТП может разрешать воспаление, восстанавливая эндотелиальный барьер путем высвобождения гепатоци-тарного фактора роста, VEGF и TGF-b [6, 10]. Высвобождение биологически активных веществ из гранул тромбоцитов, с одной стороны, подавляет активность металлопротеиназ, а с другой – стимулирует пролиферацию, что обуславливает хондропротективное действие ОТП. Из литературных источников известно также, что ОТП in vitro стимулирует выработку хондроцитами коллагена II типа, снижает уровень апоптоза хондроцитов [7].

Полученные результаты не вступают в противоречие с теоретическими данным о влиянии ГК как ингибитора экссудации, образования провоспалительных медиаторов и как составляющей метаболизма матрикса. Применение ОТП, обладающей двояким действием как на про-, так и на противовоспалительные цитокины, и значительно увеличивающей концентрацию различных факторов роста, в кратчайший срок повышает пролиферативную активность грануляционной ткани и приводит к активации поврежденной ткани хряща, таким образом разрешая воспалительный процесс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При моделировании остеоартроза в коленном суставе у половозрелых крыс линии Wistar возникают грубые структурные изменения в суставном хряще, вплоть до его полного разрушения, сопровождающегося сосудистой пролиферацией и гранулематозным воспалением.

Введение ОТП на фоне развившегося остеоартроза сопровождается снижением выраженности дегенеративно-дистрофических изменений, улучшением показателей тинкториальных свойств матрикса суставного хряща.