Экспериментальная оценка свойств костнозамещающих материалов на основе Ca3(PO4)2 на модели критического дефекта бедренной кости крысы

Проблема замещения дефектов костной ткани посттравматической и послеоперационной этиологии по-прежнему является актуальной в современной травматологии и ортопедии [1–5]. Возможности аутопластики ограничены по объёму, поэтому продолжается активная работа по поиску алло- и ксенотрансплантатов [6–11]. Достижения современного материаловедения позволяют создавать широкий спектр костнозамещающих материалов, однако выбор наиболее оптимальных из них является задачей биомедицинских исследований [3, 7, 12–17].

Для разработки новых костнозамещающих материалов применяют различные химические вещества, различающиеся как по своим механическим свойствам, так и по биорезорбируемости [12, 18–21]. Для процесса замещения материала костной тканью не меньшее значение имеет трехмерная структура материала, которая определяет процесс новообразования костной ткани и его скорость [22, 23]. Однако в литературе нет четких критериев, позволяющих выбирать архитектуру материала для ускорения процесса прорастания костью. Сама губчатая костная ткань представляет собой сложную нерегулярную трехмерную структуру с пористостью от 50 до 90 % и размером пор от 300 до 500 мкм с негомогенными анизотропными свойствами [24]. Одной из оптимальных структур с точки зрения компромисса между проницаемостью и прочностью является структура на основе трехмерной периодической минимальной поверхности типа Гироид, в то же время она обладает высокой относительной жесткостью [25].

Цель работы — определение влияния трехмерной структуры и размера пор костнозамещающих материалов на основе трикальциевого фосфата на их остеокондуктивные свойства на модели критического диафизарного дефекта бедренной кости крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемые биорезорбируемые материалы представляют собой макропористые керамические 3D-конструкции нового поколения на основе ортофосфата кальция Ca 3 (PO 4 ) 2 . Для синтеза высокопористых керамических материалов на его основе использовали фотоотверждаемые эмульсии. Для их получения применяли ранее описанную методику [25]. В качестве исходной архитектуры использовали материал Цилиндры. В этом материале общая пористость по объему составляла около 55 %, размер основных пор — 300 мкм, а переходы между ними — 50 мкм, при этом поры располагались без четкой организации.

Для формирования материалов с заданной архитектурой типа Гироид была выбрана стереолитографическая ЗD-печать с помощью DLP-принтера Ember (Autodesk, США), а трехмерные модели структур были созданы с помощью компьютерных программ Monolith (Autodesk, США) и Fusion 360 (Autodesk, США). Общая пористость созданного материала (материал Гироид) по объему составляет около 70 %, основные каналы имеют размеры 1250 мкм, и переходы между ними — 750 мкм, что обеспечивает максимальную проницаемость таких архитектур (рис. 1, слева). Использование фотоотверждаемых эмульсий позволяет задавать дополнительную моду пор в заданном керамическом 3D-каркасе. В данной работе исследованы материалы с дополнительной модой пор со средним размером 50 (материал Гироид-50 мкм) и 150 мкм (материал Гироид-150 мкм) (рис. 1, справа). Общая пористость созданных материалов по объему составляет около 85 %.

Рис. 1. Трехмерная структура созданных костнозамещающих материалов. Слева — графическая компьютерная модель структуры материала Гироид. Справа — сканирующая электронная микрофотография материала Гироид-150 мкм (увеличение 50 крат). Вид из основной поры. Определяются переходы между основными порами диаметром до 750 мкм (синие стрелки) и поры дополнительной моды диаметром 150 мкм (черные стрелки)

Работа получила одобрение Комиссии по биоэтике МГУ им. М.В. Ломоносова (одобрено на заседании 11.02.2021, рег. № 123-ж). Исследование проводили в соответствии с «Руководством по содержанию и уходу за лабораторными животными» (Межгосударственный стандарт ГОСТ 33216-2014 «Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами»).

Исследование выполнено на 66 самцах крыс Rattus norvegicus линии Wistar в возрасте 20–22 нед. из ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН (Институт цитологии и генетики СО РАН). Животных содержали в виварии по 3 особи в клетке. Доступ крыс к воде и корму был не ограничен. Формирование дефекта и заполнение его изучаемым материалом (рис. 2) проводили по описанной ранее методике [16].

Рис. 2. Ход операции: вид операционной раны с дефектом, заполненным имплантированным материалом (слева, указан стрелкой), и фиксация кости полиэ-фирэфиркетоновой пластиной и титановыми винтами (справа, пластина указана стрелкой)

Животные распределены на 4 группы по 16 особей в каждой в зависимости от имплантируемого материала. Через 3 и 6 мес. после выполнения операции по 8 крыс из каждой группы выводили из эксперимента по стандартной методике с использованием СО 2 -камеры с последующим забором материала (бедренная кость с дефектом) для гистологического исследования. Подготовку образцов для гистологического исследования осуществляли по стандартной методике [16].

Для оценки результатов проводили слепой гистометрический анализ. Изображения гистологических препаратов получали с помощью светового микроскопа Leica DM LB2 (Carl Zeiss) и цифровой камеры AxioCam ICc3 (Carl Zeiss). Оцифрованные изображения переводили в формат JPEG. Гистометрическую оценку проводили с помощью программы Fiji [26] на увеличении в 10 раз с измерением площади новообразованной костной ткани в лакунах материалов в процентах от общей площади дефекта. Для каждого образца проводили вычисление на двух препаратах, всего для каждого срока в каждой группе получали 16 значений. Результаты каждой группы представляли в виде среднего и стандартного отклонений. Для установления статистической значимости различий использовали вычисление непараметрического критерия Kruskal – Wallis с помощью программы StatSoft Statistica 10.0 (2011) отдельно для групп со сроком вывода 3 мес. и со сроком вывода 6 мес.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе проведения эксперимента от осложнений, связанных с наркозом, погибло два животных. Остальные животные перенесли оперативное вмешательство и дожили до вывода из эксперимента без особенностей. Средняя масса крыс на моменте ввода в эксперимент — (488 ± 54) г, на момент вывода через 3 мес. — (611 ± 32) г, через 6 мес. — (653 ± 56) г. Значимая разница между группами по массе и её приросту не зафиксирована (табл. 1).

Таблица 1

Масса животных в группах на момент проведения операции и вывода из эксперимента

Группа	Масса на момент включения в эксперимент, г	Масса на момент вывода из эксперимента, г
		через 3 мес.	через 6 мес.
Цилиндры	460 ± 38	606 ± 59	649 ± 71
Гироид	453 ± 42	616 ± 45	645 ± 83
Гироид-50 мкм	513 ± 26	620 ± 34	709 ± 72
Гироид-150 мкм	507 ± 36	589 ± 40	692 ± 74

Поведение животных в послеоперационном периоде не менялось, все крысы перемещались на четырех лапах без попыток ограничивать нагрузку. Гнойных осложнений раневого процесса и осложнений механического характера со стороны имплантата и кости не выявляли.

В группе Цилиндры через 3 мес. на гистологических срезах в зоне дефекта определяли прямоугольное образование серого цвета, по структуре соответствующее имплантированному материалу. В области имплантата были участки округлой формы, лишенные заполнения, что соответствовало местам резорбции материала. В порах имплантата выявляли участки врастания костной ткани (рис. 3). Через 6 мес. в области имплантата отмечено увеличение площади участков, лишенных заполнения, что соответствовало местам резорбции материала, особенно в половине, примыкающей к мягким тканям. Отмечена утрата четкости контуров имплантата, появление их сглаженности на фоне резорбции. В порах имплантата выявляли участки врастания костной ткани (рис. 3), максимальное количество которых отмечено в области костнозамещающего материала, примыкающего к костномозговому каналу. В динамике по сравнению с 3 мес. можно отметить увеличение прорастания кости в поры материала.

Рис. 3. Верхний ряд: гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 мес. (слева) и через 6 мес. (справа) после имплантации материала «Цилиндры», окраска гематоксилином и эозином, ×10. Нижний ряд: те же препараты соответственно, участки новообразованной костной ткани, ×40. Стрелками указаны островки костной ткани, вросшей в поры материала

В группе Гироид через 3 мес. в зоне дефекта отмечали зоны сохраненной структуры материала, представленные серыми полями с единичными клетками по периметру и крупными порами на месте резорбции материала. В имплантат врастала со стороны мягких тканей жировая и соединительная ткань, а со стороны кости — компактная костная ткань. Поры материала заполнены соединительной тканью с единичными врастаниями костной ткани. Со стороны костномозгового канала материал ограничен компактной костной тканью (рис. 4). Через 6 мес. в зоне дефекта можно было различить крупноячеистую сеть пустот, оставшуюся на месте материала после декальцинации. По всей площади среза отмечали прорастание костной ткани мелкими островками, повторяющими контуры пор (рис. 4).

В группе Гироид-150 мкм через 3 мес. отмечено врастание кости в поры между элементами материала, повторяющее архитектуру имплантата. В зоне, прилегающей к костномозговому каналу, отмечена массивная резорбция материала и замещение его зрелой костной тканью. Через 6 мес. отмечено врастание кости в поры материала, однако его резорбции не отмечено, поэтому статистически значимого различия в площади новообразованной костной ткани по сравнению с образцами через 3 мес. не выявлено (рис. 5).

В группе Гироид-50 мкм через 3 мес. четко прослеживается имплантированный материал с врастанием со стороны костномозгового канала островков костной ткани (рис. 6). Со стороны дефекта отмечено врастание в материал соединительной ткани.

Рис. 4. Верхний ряд: гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 месяца (слева) и через 6 месяцев (справа) после имплантации материала Гироид, окраска гематоксилином и эозином, ×10. Нижний ряд: те же препараты соответственно, участки новообразованной костной ткани, ×40. Стрелками указаны очаги врастания костной ткани в имплант

Рис. 5. Верхний ряд: гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 мес. (слева) и через 6 мес. (справа) после имплантации материала Гироид-150 мкм, окраска гематоксилином и эозином, ×10. Нижний ряд: те же препараты соответственно, участки новообразованной костной ткани, ×40. Тонкими стрелками указаны островки костной ткани, вросшей в поры материала, толстыми стрелками обозначены зоны материала

Рис. 6. Верхний ряд: гистологический препарат продольного разреза зоны монокортикального дефекта бедренной кости через 3 мес. (слева) и через 6 мес. (справа) после имплантации материала Гироид-50 мкм, окраска гематоксилином и эозином, ×10. Нижний ряд: те же препараты соответственно, участки новообразованной костной ткани, ×40. Тонкими стрелками указаны островки костной ткани, вросшей в поры материала

Через 6 мес. в группе Гироид-50 мкм в динамике отмечено увеличение числа и площади островков кости в толще имплантата, а также появление зон резорбции материала по всей толще в виде округлых пустот. Со стороны костномозгового канала отмечено обрастание имплантата костной тканью, соответствующей по структуре кортикальной кости (рис. 6).

Суммарные данные по площади новообразованной костной ткани представлены в таблице 2.

Таблица 2

Распределение величины площади новообразованной костной ткани в зоне дефекта по группам исследования — проценты к его общей площади, среднее ± выборочное стандартное отклонение

Группа	Площадь новообразованной костной ткани на момент вывода из эксперимента, %
	через 3 месяца	через 6 месяцев
Цилиндры	11 ± 4	31 ± 6
Гироид	14 ± 5	29 ± 4
Гироид-50 мкм	17 ± 7	27 ± 8
Гироид-150 мкм	39 ± 5*	41 ± 7*

Примечание : значения, обозначенные знаком *, статистически значимо отличаются от значений в других группах для данного срока наблюдения, критерий Kruskal – Wallis, р < 0,05

В группе Гироид-150 мкм статистически значимо больше площадь новообразованной костной ткани по сравнению с остальными группами исследования. При этом следует отметить, что во всех остальных группах наблюдается прорастание кости внутрь материала с течением времени, что свидетельствует о наличии остеокондуктивных свойств у всех исследуемых материалов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Критические дефекты кости, не подвергающиеся самостоятельно репарации, составляют в настоящее время одну из серьезных проблем современной медицины. Возможности применения собственной кости, трупной кости и кости животных ограничены по разным причинам (ограничение количества, риск передачи инфекций, иммунные реакции), что делает создание синтетических костнозамещающих материалов перспективным направлением современной регенеративной медицины. Активно развивающиеся в последние 10 лет технологии 3D-печати значительно расши- рили возможности создания материалов с заданной структурой, однако возникла проблема поиска наиболее эффективных образцов для замещения костной ткани, чему и посвящены многочисленные исследования последних лет.

Целью нашего исследования было установление влияния трехмерной организации пор на остео-кондуктивные свойства костнозамещающего материала. Влияние структуры пористого материала на остеокондуктивные свойства созданных из них костнозамещающих блоков в последние годы широко обсуждается в литературе [27–31]. При этом признается, что небольшие поры облегчают адгезию клеток и их первичную дифференцировку, но затрудняют дальнейшее прорастание сосудов и ухудшают питание новообразованных тканей. Очень большие поры снижают механические свойства блоков материала, из-за чего возможно их преждевременное разрушение и нарушение врастания, что особенно важно при заполнении сегментарных дефектов диафиза костей [32]. Одним из направлений решения этой проблемы является создание в одном образце пор различного диаметра, позволяющих добиться высокой пористости при сохранении механических свойств материала, чему и посвящена наша работа.

Выбор архитектуры Гироид обусловлен как предшествующими нашими работами, так и результатами исследований, показывающими теоретические преимущества этой архитектуры для процесса миграции клеток. Например, в статье S. Seehanam et al. [33] проведено сравнение структур Гироид и Diamond по различным биомеханическим параметрам и способности стимулировать рост клеток, в результате чего сделан вывод о преимуществе архитектуры Гироид с размером основных пор 500 мкм.

Результаты применения материалов in vivo в нашем исследовании сопоставимы с работами других исследователей. Так, в статье R. Wu at al. [34] проведено сравнение остеокондуктивных свойств керамического материала на основе Mg-замещенного валлостонита с диаметром пор 200, 320, 450 и 600 мкм и кубической структурой ячеек на модели критического дефекта мыщелка бедренной кости кролика на сроках от 2 до 16 нед. При этом группа Цилиндры нашего исследования соответствовала материалу с размерами пор 320 мкм, а группа Гироид — размеру пор более 600 мкм. Также как и в исследовании указанных выше авторов, лучшие остеокондуктивные и остеоиндуктивные свойства показали структуры с большим диаметром пор. Количество образованной костной ткани для материала с порами 400 и 600 мкм в сроки около 3–4 мес. (30–35 %) соответствуют группе Гироид с дополнительной модой пор 150 мкм [34]. При этом авторы данной работы использовали дефект в губчатой кости метаэпифиза бедренной кости вблизи от зоны красного костного мозга, в отличие от нашей работы, где дефект располагали в диафизарной зоне. Спецификой нашего исследования стало использование структуры типа Гироид с добавлением еще одного уровня пор, который при диаметре 150 мкм показал достоверно значимое увеличение прорастания костной ткани внутрь материала.

X. Wang at al. [35] показали положительные результаты увеличения пористости материала на основе трикальцийфосфата в виде увеличения образования костной ткани на срезах на уровне середины материала. Однако моделью в работе был дефект костей свода черепа с мембранозным костеобразованием, а сам материал получен путем вспенивания смеси порошка трикальцийфосфата, то есть без четкой 3D-организации пор. Большие продольные поры 1 мм в диаметре образованы путем высверливания в исходном блоке, исходные поры были диаметром 550 мкм, общая пористость составляла 80 %. Толщина блока была всего 1,5 мм, а диаметр — 8 мм. Авторы сообщают об уровне образования костной ткани в материале до 40–50 % через 3 мес., однако участки костной ткани повторяли размеры пор, а различия между блоками с порами и непористым материалом были только в средней части.

H.K. Lim at al. [36] изучали керамические материалы на основание гидроксиапатита и трикальциевого фосфата на модели костного дефекта черепа кролика на сроках 4 и 8 нед. В материале были только крупные основные поры размерами от 0,8 до 1,4 мм с шагом 0,2 мм без дополнительного сообщения между ними. Авторы сообщают о разрастании костной ткани к двум месяцам только до 10 %, при этом отмечают, что на данном сроке размер пор уже не влияет на количество образованной костной ткани. По сравнению с нашей работой, авторы применили меньшие сроки наблюдения, простую форму решетки и отсутствие пор в материалах, а также модель дефекта черепа, что, вероятно, и обусловило худшие гистологические результаты.

K. Shibahara at al. [37] также изучали влияние микропор на остеокондуктивные свойства керамического костнозамещающего материала (в работе карбонатзамещенный апатит). Однако размер основных пор был значительно меньше (около 300 мкм), их структура линейная («сотовое» расположение), а микропоры размером около 1 мкм расположены хаотично. Данный материал соответствует архитектуре Цилиндры в нашем исследовании. Свойства in vivo проверяли на модели дефекта локтевой кости кролика с дополнительной фиксацией пластиной и винтами на сроках 1 и 4 мес. Площадь новообразованной костной ткани даже через 4 мес. в группе с большими порами и большими микропорами составила всего 12 %, в группах с меньшими размерами пор этот показатель был менее 10 %, что сопоставимо с нашими результатами в группе Цилиндры. Это говорит о необходимости создания в материале основной группы пор диаметром больше 1 мм для более быстрого врастания тканей, а модификация должна проводиться уже в соединениях пор и микропорах, которые создают необходимые условиях для дифференцировки клеток и ускоряют процесс резорбции костнозамещающего материала.

J. Jiao et al. [32] изучали влияние пористости (60, 70 и 80 %) костнозамещающего материала из тантала на его остеокондуктивные свойства. Размер основных пор был соответственно 450, 600 и 800 мкм, а соединения между ними — 100 мкм. 3D-структуру авторы описали как бионическую трабекулярную, соответствующую структуре нативной губчатой кости. Для изучения свойств in vivo использовали модель некритического метафизарного дефекта наружного мыщелка бедренной кости крысы размерами 3 мм в диаметре и 5 мм в глубину на сроках 6 и 12 нед. после имплантации. Авторы сообщают о площади новообразованной костной ткани через 12 нед. в группах с пористостью 60, 70 и 80 % соответственно 14,3 %, 28,6 %, и 23,3 %, что уступает результатам в группе Гироид — 150 мкм через 3 мес., однако больше, чем площадь новообразованной костной ткани в других группах. Объяснение этому факту лежит в большей общей пористости нашего материала (около 85 %) и более сложной структуре пор, что оказывает принципиальное влияние на остеокондуктивные свойства материала. Особенностью материалов из металлов (титан, тантал и их сплавы) является невозможность его резорбции и сохранение постоянного размера пор в течение всего времени остеоинтеграции.

Мы согласны с авторами, считающими, что в настоящее время нет единых подходов к изучению кост-нозамещающих материалов на животных моделях, это очень сильно затрудняет сравнение результатов и выработку рекомендаций для клинической практики [32].

В результате нашего исследования можно сделать вывод о положительном влиянии выбора структуры Гироид с большим диаметром основных пор (более 1 мм) и добавления при печати в структуру материала дополнительных соединительных каналов средним диаметром 150 мкм. Это позволяет достоверно увеличить количество новообразованной костной ткани и, соответственно, улучшить остеокондук-тивные свойства костнозамещающего материала на основе керамики. Причиной данного явления может быть влияние поверхности пор с определенной кривизной на дифференциацию прогенитор-ных клеток по остеобластическому пути, что отражается в большем количестве врастающей костной ткани. Однако отсутствие нарастания количества новообразованной костной ткани при сравнении сроков наблюдения в 3 и 6 мес. говорит о недостаточной способности к резорбции выбранного вещества (трикальциевый фосфат), поскольку максимум прорастания достигается уже на ранних сроках и в дальнейшем ограничивается именно сохранением материала в объеме дефекта. Таким образом, пути дальнейшего повышения остеокондуктивных свойств лежат не только в оптимизации архитектуры материала, но и в выборе для его построения вещества с большей способностью к резорбции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Добавление в структуру керамических материалов на основании трикальциевого фосфата Гироида дополнительной моды пор до 150 мкм в диаметре позволяет статистически значимо увеличить количество новообразованной костной ткани и улучшить остеокондуктивные свойства материала.