Экспериментальная оценка влияния фенолов на иммунорегуляцию ex vivo

Токсическое воздействие низкомолекулярных химических веществ, в том числе фенолов, может привести к нарушению иммунологической реактивности и искажению баланса иммунорегуляторных механизмов [2, 3, 5, 7–9]. Накопление изменений отдельных компартментов иммунной защиты в условиях экспозиции химическими контаминантами может реализоваться нарушениями структурной целостности и функциональной полноценности иммунной системы, прежде всего у детей, что может служить предпосылкой для развития целого ряда соматических заболеваний, среди которых аллергические, аутоиммунные заболевания и пролиферативные процессы [1–4, 6]. В рамках этого актуальным является изучение влияния фенолов на иммунорегуляцию в условиях эксперимента.

Цель исследования – верификация ex vivo нарушений иммунной регуляции у детей в условиях воздействия фенола.

Материалы и методы. Предметом исследования являлись биосреды (кровь), в том числе клеточные культуры мононуклеаров и фагоцитов детей.

С целью выявления непосредственного влияния фенола на регуляцию иммунной системы оценивали экспрессию выработки цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-α, ИФН-γ) в условиях ex vivo . Для этого изучали уровни спонтанной, индуцированной митогеном (фитогемагглютинин, 4 мкг/мл; конкавалин А, 4 мкг/мл; липополисахарид, 2 мкг/мл) и фенолом (0,05 мг/дм³) продукции цитокинов в супернатантах цельной периферической крови методом иммуноферментного анализа c использованием тест-систем «Вектор-Бест» (Россия) на анализаторе Elx808IU (США). Влияние фенола на фагоцитарную активность определяли в условиях эксперимента путем добавления фенола (0,05 мг/дм³) в кровь перед инкубацией с формалинизированными эритроцитами барана. Рабочую концентрацию фенола подбирали опытным путем (исследовали влияние на клетки трех концентраций фенола: 0,01; 0,05 и 0,1 мг/дм³)

по оценке визуальных изменений мембраны иммуноцитов и оценке фагоцитарной активности нейтрофилов.

Для статистической обработки результатов исследования применяли методы математической статистики на базе современного компьютерного обеспечения с использованием программы Microsoft^® Office Excel 2003 и пакета статистического анализа Sta-tistica 6.0 (StatSoft, США). Для оценки уровня достоверности полученных результатов использовали параметрический критерий Стьюдента (сравнение групп по количественным признакам). Различия полученных результатов являлись статистически значимыми при р ≤ 0,05. Для изучения взаимосвязи двух метрических переменных, измеренных на одной и той же выборке, применялся коэффициент корреляции Спирмена. Результаты исследования представлены в виде среднего значения ( M ) и ошибки среднего ( m ) изученных показателей.

Результаты и их обсуждение. Проведен анализ модулирующего действия фено- ла на показатели регуляции иммунной системы в условиях эксперимента. В результате оценки спонтанной продукции цитокинов клетками периферической крови обследуемых детей, характеризующей текущую активацию клеток иммунной системы, установлено статистически значимое (p < 0,05) повышение уровня содержания ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 в 3,4; 4,1 и 5,8 раза соответственно у детей основной группы по отношению к аналогичным показателям группы сравнения (табл. 1).

При исследовании спонтанной продукции ИЛ-17, ФНО-α и ИФН-γ у детей группы наблюдения обнаружено снижение данных показателей в 2,8; 1,9 и 2,6 раза соответственно по отношению к группе сравнения (см. табл. 1).

Полученные результаты свидетельствуют, что у детей, проживающих в условиях внешнесредового воздействия фенолов, наблюдается супрессия иммунного ответа с замедлением апоптотической активности лимфоцитов (снижение ФНО- α) и нарушением

Таблица 1

Сравнительная характеристика продукции цитокинов мононуклеарами у детей, пг/мл

Показатель продукции цитокинов		Основная группа ( n =85)	Группа сравнения ( n =30)	Межгрупповое различие ( р )
ИЛ-1β	Спонтанная	13,45±2,90	4,00±1,07	0,003
	Индуцированная митогеном	7560,31±552,19	4569,83±414,06	0,000
	Индуцированная фенолом	799,49±133,29	193,10±10,95	0,001
ИЛ-4	Спонтанная	0,71±0,05	1,40±0,15	0,000
	Индуцированная митогеном	1,48±0,11	4,26±0,35	0,000
	Индуцированная фенолом	0,85±0,05	3,57±0,34	0,000
ИЛ-6	Спонтанная	65,30±9,79	15,79±5,09	0,022
	Индуцированная митогеном	29241,73±1527,21	19556,67±1359,10	0,000
	Индуцированная фенолом	9373,95±970,08	1850,69±307,58	0,000
ИЛ-8	Спонтанная	1900,62±294,56	325,04±79,83	0,001
	Индуцированная митогеном	27100,86±1466,79	19506,67±1765,85	0,004
	Индуцированная фенолом	20296,24±1921,33	935,02±203,51	0,000
ИЛ-10	Спонтанная	2,68±0,76	2,07±0,28	0,171
	Индуцированная митогеном	176,69±24,79	99,81±8,89	0,028
	Индуцированная фенолом	27,07±4,85	17,52±1,88	0,166
ИЛ-17	Спонтанная	1,40±0,13	3,97±0,15	0,000
	Индуцированная митогеном	16,33±3,80	28,16±3,55	0,486
	Индуцированная фенолом	1,94±0,49	5,09±0,24	0,062
ФНО-α	Спонтанная	5,00±0,91	9,51±0,96	0,001
	Индуцированная митогеном	1991,40±175,66	3036,67±270,53	0,002
	Индуцированная фенолом	111,15±21,28	105,39±8,88	0,877
ИФН-γ	Спонтанная	2,18±0,49	5,60±0,85	0,001
	Индуцированная митогеном	647,61±108,14	300,17±40,15	0,023
	Индуцированная фенолом	3,07±0,51	7,85±1,05	0,316

Таблица 2

Показатели фагоцитарного звена иммунитета у детей в условиях эксперимента ex vivo

Показатель	Спонтанный уровень		р 1	Уровень, индуцированный фенолом		р 2	р 3	р 4
	Основная группа ( n =17) M±m	Группа сравнения ( n =15) M±m		Основная группа ( n =17) M±m	Группа сравнения ( n =15) M±m
Процент фагоцитоза	43,82±2,2	52,00±3,1	<0,05	39,00±2,5	51,47±3,4	<0,05	<0,05	>0,05
Фагоцитарное число, усл. ед.	0,71±0,05	0,92±0,08	<0,05	0,53±0,04	0,84±0,07	<0,05	<0,05	>0,05
Абсолютный фагоцитоз, 109/л	1,300±0,1	2,850±0,5	<0,05	1,16±0,1	2,66±0,5	<0,05	>0,05	>0,05

Примечание:

р i - достоверность межгрупповых различий ( р < 0,05) спонтанного фагоцитоза;

р ₂ - достоверность межгрупповых различий (р <  0,05) индуцированного фагоцитоза;

р ₃ - достоверность различий (р <  0,05) спонтанного и индуцированного фагоцитоза в основной группе;

р ₄ - достоверность различий (р < 0,05) спонтанного и индуцированного фагоцитоза в группе сравнения.

баланса цитокинпродуцирующей активности иммуноцитов, характеризующимся интенсификацией регуляции иммунного ответ за счет примитивных лейкоцитарных ростков (ИЛ-1в, ИЛ-8) и угнетением Th 1-звена иммунитета (снижение ИФН - y ).

Обнаружено, что клетки периферической крови обследуемых детей обладают высоким цитокинпродуктивным потенциалом, что проявляется в статистически значимом повышении продукции изучаемых цитокинов в режиме митогенной стимуляции. Это связано, с одной стороны, с особенностью клеток детского организма к быстрому ответу, с другой - отражает биологическое значение исследуемых цитокинов как активаторов и регуляторов многих физиологических и патологических процессов.

В сравнительном анализе митоген-индуцированной продукции цитокинов установлено достоверное (р < 0,05) повышение выработки ИЛ-1 в , ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИФН- Y клетками крови детей основной группы в 1,7; 1,5; 1,4; 1,8 и 2,2 раза по сравнению с аналогичными показателями группы сравнения (табл. 2). Подобранная опытным путем для условий эксперимента рабочая концентрация фенола, равная 0,05 мг/дм³, характеризовалась отсутствием визуальных изменений мембраны иммунных клеток и не вызывала потерю способности нейтрофилов к фагоцитозу.

В результате исследования стимулированной фенолом продукции цитокинов мо-нонуклеарами периферической крови обнаружено, что фенол в концентрации 0,05 мг/дм3 оказывает цитокинстимулирующее влияние в отношение как про-, так и противовоспалительных цитокинов. При этом фенол обладает более существенной способностью активировать синтез цитокинов при взаимодействии с клетками крови детей, проживающих в условиях внешнесредового воздействия фенолов. Так, у детей основной группы выявлена повышенная фенолиндуцированная активация синтеза ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНО-а - в 1,2; 1,2; 3,7; 1,2 и 2,0 раза соответственно по отношению к аналогичным показателям группы сравнения. При этом не наблюдалось активации синтеза ИЛ-17 и ИФН-у при влиянии фенола у детей основной группы.

Исследование фагоцитарного звена иммунитета в условиях экспериментальной экспозиции фенолом у детей основной группы показало статистически значимое (р <0,05) снижение относительного фагоцитоза и фагоцитарного числа (табл. 2).

Полученные данные свидетельствуют об угнетении фагоцитарной активности им-муноцитов под действием фенола у детей с содержанием его в крови, изначально превышающим фоновую концентрацию и концентрацию группы сравнения.

Выводы. Экспериментально доказано модулирующее действие фенола на продукцию цитокинов мононуклеарами и фагоцитарную активность нейтрофилов, что выражается достоверной стимуляцией индуцированной фенолом продукции ИЛ-1β, ИЛ-6,

ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-α в 1,2; 1,2; 3,7; 1,2 и 2,0 раза по отношению к группе сравнения, супрессией индуцированной продукции по критериям ИНФ- γ и ИЛ-17, снижением относительного фагоцитоза и фагоцитарного числа.