Экспериментальная оценка влияния изоборнилфенолов на развитие ДГПЖ и редокс-потенциал клеток предстательной железы

Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ) – наиболее частое урологическое забо левание у пожилых мужчин. Для него характерно раз витие железисто-стромальной гиперплазии предста тельной железы (ПЖ) с образованием новых желези стых структур и последующим развитием симптомов нарушения функции нижних мочевыводящих путей. Сегодня применяются эффективные способы лекарст венного воздействия на это заболевание (альфа-1-адре ноблокаторы, М-холинолитики, агонисты бета-3-адрено рецепторов, ингибиторы 5-альфа-редуктазы, ингиби торы фосфодиэстеразы 5-го типа). Они сформирова лись на основе представлений о патогенезе ДГПЖ, как локального (органного) патологического процесса и ее симптомов. Однако существующие средства фармако терапии ДГПЖ обладают побочными эффектами, огра ничивающими их применение. По данным S.K. Bechis и соавт. более 30% мужчин вообще не реагируют на тера певтические эффекты ингибиторов 5-альфа-редуктазы [1]. В то же время частота встречаемости этой патоло гии с течением времени возрастает,что связывают не только с общим старением населения и усовершенство ванием методов диагностики, но и с недостаточной эф фективностью системы профилактики и лечения [2]. Это побуждает к более тщательному активному к по иску новых альтернативных средств ее профилактики и лечения ДГПЖ.

В настоящее время установлено, что патогенез этого заболевания является многофакторным [3, 4]. По казано, что одним из возможных механизмов развития ДГПЖ является окислительный стресс, который, в пер вую очередь, может быть результатом целого ряда пато логических реакций, наблюдаемых при ее развитии [5-8]. В связи с этим каскад окислительного стресса может быть потенциальной мишенью для лечения ДГПЖ. В настоящее время выявлены антиоксиданты с различным механизмом действия, которые могут быть потенциально эффективными для коррекции окисли тельного стресса наиболее распространенных заболева ний мужской репродуктивной сферы, в том числе и патологий предстательной железы [7, 9]. К их числу от носятся соединения фенольной природы.Эффектив ность соединений такого типа, как антиоксиданты, доказана и при многих патологических состояниях дру гих систем органов [10]. Роль фенольных антиоксидан тов в лечении ДГПЖ в настоящее время интенсивно изучается [11, 12]. По данным C. Eleazu и соавт. ткань ПЖ обладает высокой чувствительностью к соедине ниям полифенольной природы [9]. Показано, что они могут быть эффективными средствами лечения данной патологии. В то же время установлено, что ряд полифе нолов может оказывать неблагоприятное воздействие на прогрессирование ДГПЖ из-за их возможного взаи модействия с ферментами цитохрома Р459 (CYP A4), уча ствующего в метаболизме тестостерона [9]. Отмеченное выше свидетельствует о необходимости строго контролируемого использования полифенолов при лечении ДГПЖ.

Установлено, что антиоксидантные свойства полифенолов могут существенно усиливаться при наличии стерически затрудненной ОН-группы [10]. Высокая антиоксидантная активность пространственно-затрудненных фенолов связана с их способностью к образованию устойчивых радикалов, которые далее не участвуют в реакциях продолжения цепей окисления. К числу эффективных средств, воздействующих на ДГПЖ, относятся Диборнол (2,6-диизоборнил-4-метилфенол) и его гидро-ксиметильное производное (2,6-диизоборнил-4-гидро-ксиметилфенолов [11]. Диборнол является перспективной фармацевтической субстанцией, прошедшей доклинические исследования и имеющей широкий спектр фармакологической активности. Доказана его антиоксидантная, гемореологическая, антитромбоцитарная, анти-тромбогенная, противоишемическая, кардиопротектор-ная активность [13, 14]. В настоящее время показана перспективность функциональных производных изоборнилфенолов в качестве новых фармакологических веществ [14-18]. Конъюгаты терпенофенолов с полиса харидами обладают водорастворимостью, а также фар макологической активностью [19-21].

Авторами настоящего исследования ранее показано, что гидроксиметильное производное Диборнола – 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенол (продукт окисления Диборнола по метильной группе) в сульпиридной модели ДГПЖ является более эффективным, чем Дибор-нол [11]. Однако остается открытым вопрос, в какой мере эффективность Диборнола и 4-гидроксиметил-2,6-ди-изоборнилфенола обусловлена их влиянием на уровень свободных радикалов, антиоксидантной защиты и редокс-потенциал клеток простатической ткани. С практической точки зрения открытым является и вопрос, в какой мере их терапевтическое действие и влияние на редокс-потенциал сопоставимо с таковым при использовании широко применяемого сегодня в урологической практике препарата Простамол Уно. Последний, помимо основного механизма действия (ингибирование 1-го и 2го типов 5-альфа-редуктазы), обладает способностью снижать уровень окислительно-восстановительных реакций в ткани ПЖ [22, 23].

Целью данного исследования было изучение влияния фенолов с объемным изоборнильным заместителем (2,6-диизоборнил-4-метилфенол и 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенол) на рост экспериментальной ДГПЖ и антиоксидантный баланс клеток предстательной железы в сравнении с препаратом Простамол Уно.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на 50 крысах-самцах популяции Wistar (возраст 10 месяцев, масса тела 450-660 г). Животные были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИ им. Гольдберга Томского НИМЦ. Крыс выращивали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (Страсбург, 1986 г.), с требованиями приказа Минздрава РФ от 04.01.2016 №199 «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики».

ДГПЖ была вызвана гиперпролактинемией, при которой сульпирид вводили ежедневно в течение 60 дней самцам крыс позднего репродуктивного возраста [24, 25]. Перед началом экспериментов у всех исследованных животных определяли массу тела.

Животные были разделены на группы: I – фон – интактные животные; II – контроль – сульпирид; III опыт – сульпирид + субстанция Диборнол (ДБ), IV – опыт – су льпирид + субстанция 4-гидроксиметил-2,6-диизобор-нилфенол (ГДБ), V – опыт – сульпирид + Простамол Уно (ПУ). Рандомизация проводилась с учетом массы тела животных. Субстанции 4-метил-2,6-диизоборнилфенола и 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенола были синтезированы в Институте химии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН. Продолжительность введения всех используемых препаратов составляла 60 дней.

Сульпирид (эглонил; SANOFI-AVENTIS) вводили ежедневно (однократно) внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг. В экспериментах использовали исследуемое вещество в виде стерильного раствора в заводских ампулах по 50 мг в 1 мл. Препараты ДБ, ГДБ, ПУ вводили ежедневно один раз в сутки перорально в течение 60 дней. ДБ вводили в дозе 10 мг/кг, ГДБ – 10 мг/кг. Дозы исследуемых антиоксидантов подбирались с учетом их биодоступности для достижения эквивалентной концентрации в плазме крови животного. Исследуемые фенольные соединения вводили в виде суспензий в растворе крахмала (2%). ПУ применяли в дозе 50 мг/кг один раз в сутки перорально.

Доза соответствовала терапевтической дозе при клиническом применении. Капсулы экстракта Serenoa repens по 320 мг производства Berlin-Chemie AG/Menarini Group (Германия) – препарат Простамол Уно – растворяли в водно-спиртовом растворе (2%).

Через 2 месяца после начала эксперимента животных взвешивали (для определения массовых коэффициентов железы), затем умерщвляли в СО2 камере. Определяли массу, массовый коэффициент и объем латеральной доли ПЖ. Абсолютную массу вентральной доли железы определяли путем взвешивания на электронных весах. Одну часть ПЖ использовали для морфологического анализа, другую – для изучения анти-прооксидантного статуса. Для морфологического анализа изолированную долю железы фиксировали в 10% формалине и заливали парафином. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На окрашенных срезах с помощью компьютерной системы анализа цветового изображения: микроскопа МИКМЕД-5, а также с помощью графического компьютерного анализа на стандартной площади (10 последовательных полей зрения) измеряли площадь эпителиальных структур, стромы, вычисляли стромально-железистое соотношение. Подсчитывали среднее количество пролиферативных центров, имеющих 2-3 плотно-прилегающих друг к другу ацинуса (1-го типа) и пролиферативные центры, имеющие дочерние ацинусы (2-го типа), очагов с выраженной инфильтрацией стромы (абс.), количество кистозных расширений.

Прооксидантную и антиоксидантную активность (АОА) определяли с помощью индуцированной люминолом хемилюминесценции и методом гашения интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) в радикалопродуцирующей системе после добавления биологической пробы соответственно с помощью кюветного биолюминометра Lumat LB9507 (Berthold Technologies, США) [26]. Количественный уровень хемилюминесцен- ции и АОА определяли с помощью светосуммы хеми люминесценции образца гомогената ткани,которую выражали в RLU/1г ткани/сек, где RLU (относительная единица света relative light units = 10 фотонам). Анти-прооксидантный баланс определяли по отношению светосуммы АОА(SmAOA) к светосумме ХЛ (SmХЛ). Результаты обрабатывали методом вариационной ста тистики с использованием непараметрического U кри терия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При изучении морфологии в ткани ПЖ крыс ин тактной группы патологические изменения не выявля лись (рис. 1аА). У животных, получавших сульпирид, отмечалось развитие аденоматозной формы

Рис. 1. Морфологическое состояние вентральной доли предстательной железы крыс

А) Вентральная доля ПЖ интактных животных. Ацинусы, выстланные однослойным цилиндрическим эпителием, между ними – тонкие прослойки соединительной ткани; Б) вентральная доля ПЖ крыс, получавших сульпирид. Аденоматозная форма гиперплазии. Ацинарные структуры с папиллярными разрастаниями (стрелки); клеточная инфильтрация стромы; усиленное слущивание эпителиальных клеток в просвет ацинусов;

В) вентральная доля ПЖ крыс, получавших сульпирид и ДБ. Центры пролиферации, состоящие из 2-3 близко прилегающих друг к другу ацинусов (стрелка); Г) ПЖ крыс с ДГПЖ, получавших ГДБ. Уменьшение площади эпителия ацинусов, папиллярные разрастания в ацинарных структурах, слущивание эпителиальных клеток в просвет ацинуса не выявляется. Окраска гематоксилин-эозином, х 100.

Fig. 1. Morphological study of rat prostate tissue

A) Ventral lobe of the pancreas of intact animals. Acini, lined with a single-layer columnar epithelium, between them there are thin layers of connective tissue; Б) the ventral lobe of the pancreas of rats treated with sulpiride. Adenomatous form of hyperplasia. Acinar structures with papillary growths (arrows); cellular infiltration of the stroma; increased desquamation of epithelial cells into the lumen of the acini. В) the ventral lobe of the pancreas of rats treated with sulpiride and DB. Proliferation centers, consisting of 2-3 closely adjacent acini (arrow); Г) RV of rats with BPH treated with HDB. A decrease in the area of the acinus epithelium, papillary growths in the acinar structures, desquamation of epithelial cells into the lumen of the acinus are not detected. Hematoxylin-eosin staining, x 100.

доброкачественной гиперплазии (ацинарные структуры окруженные прослойками соединительной ткани). В ацинусах встречались папиллярные разрастания эпите лия. Помимо этого, наблюдалось разрастание соедини тельной ткани стромы, появление очагов ее клеточной инфильтрации, усиленное слущивание эпителиальных клеток в просвет ацинусов, кистозное расширения аци нусов (рис. 1Б). В ткани ПЖ крыс этой группы выявля лись пролиферативные процессы, наблюдаемые при развитии ДГПЖ у человека, что подтверждает адекват ность используемой модели [27]. Начальная стадия представляла собой центры пролиферации, состоящие из 2-3 плотно прилегающих друг к другу ацинусов (про лиферативный центр 1-го типа, рис. 1В, указано стрел ками). На последующей стадии, наблюдалось появление дочерних ацинусов (центры пролиферации 2-го типа рис. 1б, указано стрелками). У самцов, получавших су льпирид и антиоксиданты, разрастание площади эпите лия ацинусов, папиллярные разрастания, слущивание эпителиальных клеток были менее выражены (рис. 1Г).

Результаты количественного морфологического анализа представлены в таблице 1. Выявлено, что вве дение сульпирида в дозе 40 мг/кг крысам в течение двух месяцев приводило к достоверному возрастанию (в 4,5 раза) массового коэффициента боковой доли же лезы и ее объема (в 4,2 раза). Учитывая, что масса тела крыс при этом не возрастала, то этот эффект обуслов лен, очевидно, действием сульпирида. Относительная площадь эпителия ацинусов статистически значимо увеличивалась на 33%, площадь соединительной ткани стромы – на 25% по сравнению со значениями фона. Железисто-стромальное соотношение снижалось, что очевидно является результатом опережающего разви тия эпителиального компонента. О гиперплазии эпите

Таблица 1. Влияние антиоксидантов на морфологическое состояние предстательной железы крыс-самцов при экспериментальной модели доброкачественной гиперплазии

Table 1. The effect of antioxidants on the morphological state of the prostate of male rats in an experimental model of benign hyperplasia

Показатель/группа Index/ Group	Фон Background	Контроль Control	ДБ DB	ГДБ GDB	ПУ PU
Вес животного в конце эксперимента, г The weight of the animal at the end of the experiment, g	559,00±13,39	564,17±28,17	547,83±26,24	600,40±28,28	496,20±20,34 #
Масса боковой доли ПЖ, г The mass of the lateral lobe of the prostate, g	74,00±9,27	363,33±31,69#	373,33±39,04#	364,00±14,00#	396,00±82,98 #
Массовый коэффициент боковой доли ПЖ, мг/г The mass coefficient of the lateral lobe of the prostate, mg/g	0,13±0,02	0,59±0,08 #	0,69±0,88 #	0,61±0,01 #	0,68±0,10 #
Объем боковой доли ПЖ, см3 The volume of the lateral lobe of the prostate, cm3	0,16±0,02	0,67±0,07 #	0,65±0,07 #	0,62±0,08 #	0,70±0,17 #
Относительная площадь (%) эпителия ацинусов на стандартной площади среза The relative area (%) of the acini epithelium on a standard cut area	15,43±2,43	20,59±1,15 #	17,16±0,77*	13,54 ±1,22*	21,56±2,26
Относительная площадь (%) стромы на стандартной площади среза The relative area (%) of the stroma on the standard cut area	34,73±3,29	43,52±1,46 #	41,69±2,14	41,87 ±2,22#	46,47±2,13 #
Стромально-эпителиальное соотношение на стандартной площади среза Stromal-epithelial ratio in a standard cut area	2,72±0,78	2,15±0,18	2,47±0,26	3,03±0,47*	2,26±0,27
Количество пролиферативных центров (абс.), имеющих 2-3 плотно-прилегающих друг к другу ацинуса на стандартной площади среза The number of proliferative centers (abs.), having 2-3 acini tightly adjacent to each other on a standard cut area	0,00±0,00	2,20±0,58 #	1,90± 0,81 #	1,00 ±0,55 #	1.40 ±0,40 #
Количество пролиферативных центров, имеющих дочерние ацинусы (абс.) на стандартной площади среза The number of proliferative centers with daughter acini (abs.) оn a standard cut area	0,00±0,00	3,20 ±0,60 #	1,20 ±0,58*#	1,20±0,37*#	1,00±0,32*#
Количество центров (%) с выраженными проявлениями лимфоидной инфильтрации стромы The number of centers (%) with severe manifestations of lymphoid infiltration of the stroma	0,00±0,00	2,40±0,93#	0,60±0,24*#	2,00±1,05#	1,60±0,24#
Количество кистозных расширений, абс. The number of cystic extensions, abs.	0,00±0,00	1,40 ±0,68#	1,20±0,37#	1,60±1,71#	1,40±0,51#

* различия достоверны при сравнении с контролем (р≤0,05, U-критерий Манна-Уитни); # – различия достоверны при сравнении с фоном ( р <0,05, U-критерий Манна-Уитни)

* differences are significant when compared with control (p≤0.05, Mann-Whitney U-test); # – differences are significant when compared with the background ( p <0.05, Mann-Whitney U-test)

лиальных структур свидетельствовало наличие центров пролиферации первого и второго типа. Среднее коли чество очагов клеточной инфильтрации составляло 2,4±0,93, кистозных расширений ацинусов – 1,4±0,68.

Масса, массовый коэффициент и объем вентраль ной доли ПЖ крыс, которым вводили все исследуемые препараты, не отличались от таковых в контроле. Значе ния этих показателей у животных, получавших ПУ, со гласуются с результатами многолетнего опыта использования этого препарата в клинической практике [28]. Площадь эпителия ацинусов в группах животных, ко торым вводили ДБ и ГДБ, оказалась статистически значимо сниженной по сравнению с контролем (табл. 1) на 17 и13,5% соответственно, что свидетельствует о более высокой эффективности ГДБ. В группе животных, получавших ПУ, этот показатель оставался на уровне контрольных значений. При подсчете площади стромы выявлено, что на фоне введения всех исследуемых пре паратов этот показатель оставался на уровне значений группы контроля. Железисто-стромальное соотноше ние в группе крыс, получавших ДБ и ПУ, статистически значимо не отличалось от фоновых значений, а у крыс, которым вводили ГДБ, этот показатель статистически значимо возрастал по сравнению с таковым у интакт ных животных, что также свидетельствует о более вы сокой эффективности ГДБ.Введение антиоксидантов практически не оказало влияние на формирование про лиферативных центров 1-го типа. В то же время обра зование центров пролиферации 2-го типа у крыс всех групп исследования происходило в равной степени не интенсивно. Количество очагов с выраженной лимфо идной инфильтрацией в ткани железы статистически значимо снижалось у животных всех эксперименталь ных групп. Наиболее существенное снижение этого по казателя выявлялось на фоне введения ДБ. В то же время введение исследуемых препаратов не препятство вало развитию кистозных расширений.

Результаты изучения анти-прооксидантной активности ткани ПЖ крыс-самцов представлены на рисунке 2. Выявлено, что уровень светосуммы свободных радикалов в ткани железы контрольных животных статистически значимо превышал таковой показатель у интактных животных (на 60%). Антиоксидантная активность была снижена на 74,4%. Редокс потенциал уменьшался более, чем в 6 раз. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что прогресирование патологического процесса сопровождалось развитием в клетках предстательной железы выраженного окислительного стресса. Это подтверждает тот факт, что окислительный стресс может быть важным фактором патогенеза ДГПЖ. Уровень свето суммы свободных радикалов у животных эксперимен тальных групп статистически значимо снижался (почти в 2 раза) по сравнению с контролем (сульпи рид). Антирадикальная активность исследуемых пре паратов оказалась сходной по степени выраженности.

• □    Фон □ Контроль (ДГПЖ) ^Диборнол

Вackground  Control (BPH)              Dibornal

• □    Проста ген ин □ Простамол Уно

Prostagenin          Prostsamol Uno

Рис. 2. Влияние антиоксидантов на антиоксидантно-прооксидантный баланс ПЖ крыс с ДГПЖ А – уровень светосуммы индуцированной хемилюминисценции гомогената ПЖ;

Б – уровень светосуммы антиоксидантной активности гомогената ПЖ;

В – антиоксидантно-прооксидантный баланс гомогената ПЖ

Примечания: *различия достоверны при сравнении с контолем ( р ≤0,05, U-критерий Манна-Уитни) # – различия достоверны при сравнении с фоном ( р <0,05, U-критерий Манна-Уитни) Fig. 2. The effect of antioxidants on the antioxidant-prooxidant balance of the prostate of rats with BPH A – the level of the light sum of the induced chemiluminescence of the homogenate of the prostate gland;

Б – the level of the light sum of the antioxidant activity of the prostate homogenate;

B – antioxidant-prooxidant balance of prostate homogenate

Notes: * – differences are significant when compared with control ( p ≤0.05, Mann-Whitney U-test) # – differences are significant when compared with the background ( p <0.05, Mann-Whitney U-test)

Антиоксидантная активность возрастала (в 2-3 раза) причем наиболее выраженное влияние на этот показа тель наблюдалось на фоне введения ГДБ и ПУ. Редокс потенциал во всех экспериментальных группах много кратно возрастал и статистичеки значимо не отли чался от такового у фоновых животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Обобщая полученные данные можно заключить что морфологические признаки доброкачественной ги перплазии в ПЖ крыс экспериментальных групп, были выражены в меньшей степени, чем при введении одного сульпирида (контроль). Выявляется и общая направлен ность наиболее существенных терапевтических эффек тов, которые характеризуются торможением развития гиперплазии эпителия ацинусов ПЖ. Обращает на себя внимание тот факт, что эффективность исследуемых пре паратов характеризовалась разной степенью выраженно сти. Она снижалась в следующей последовательности ГДБ→ДБ→ПУ. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения изоборнилфе нолов как простатотропных средств. Наибольший тера певтический эффект наблюдался в группе животных получавших ГДБ (рис. 1Г), что подтверждает литератур ные данные о том, что функциональные производные изоборнилфенолов могут быть более эффективными фармакологическими субстанциями, чем исходные со единения [16, 18, 21].

При сопоставлении результатов оценки анти-про оксидантного статуса с терапевтическим эффектом ис следуемых препаратов, обращает на себя внимание тот факт, что изоборнилфенолы, обладающие высокой эф фективностью как простатотропные средства, не про являли более значимого влияния по сравнению с ПУ, на редокс-потенциал клеток простатической ткани. В связи с этим, нельзя исключить, что способность этих соединений препятствовать развитию ДГПЖ может быть обусловлена не только их антиоксидантными свойствами,но и другой фармакологической актив ностью. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что ДБ обладает противоишемической актив ностью [12]. Это свойство препарата является высоко востребованным при лечении ДГПЖ, поскольку, по данным В.И. Кирпатовского и соавт., ишемия ткани ПЖ является самостоятельным патогенетическим фак тором развития этой патологии [4].

ВЫВОДЫ

Препараты ДБ, ГДБ, ПУ оказывают нормализую щие влияние на уровень выраженности окислительно-востановительных реакций в сульпиридной модели ДГПЖ. Это сопровождается значимым терапевтиче ским эффектом. Сопоставляя результаты морфологи ческого исследования с таковыми по изучению анти прооксидантного статуса, можно, по-видимому, гово рить о том, что терапевтические эффекты изоборнил фенолов и Простамола Уно связаны с их антиокси дантным действием. Исследуемые препараты оказы вали равное по степени выраженности антиоксидант ное воздействие. В то же время изоборнилфенолы и ПУ отличаются друг от друга по степени выраженности ле чебного воздействия. Эфективность фенольных соеди нений превосходила таковую у ПУ. Очевидно, что их высокая эффективность может быть связана не только с антиоксидантными свойствами. Наибольшее терапев тическе действие выявлено у ГДБ, что позволяет счи тать целесообразным дальнейшее экспериментальное изучение простатотропной активности ГДБ. Кроме того, его эффективность должна быть доказана в кли нических исследованиях.