Экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации актинобактерий в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем

Интенсификация микробиологических процессов очистки промышленных сточных вод является одной из задач экологической биотехнологии, решение которой предусматривает использование иммобилизованных на носителе микроорганизмов (биокатализаторов) и биореакторов различного типа. Иммобилизация позволяет поддерживать высокую плотность активной биомассы и многократно использовать микробные клетки, способствует их адаптации к залповому поступлению загрязняющих веществ и повышению каталитической мощности, а также снимает необходимость отделять биомассу от реакционной среды [ 3, 6, 8 ] . В качестве носителя для иммобилизации актинобактерий рода Rhodococcus , имеющих гидрофобную клеточную стенку, авторами используются гидрофобизованные Rhodococcus -биосурфактантом хвойные опилки [ 5 ] .

Использование биореакторов усовершенствованных конструкций дает возможность регулировать и подбирать оптимальный рабочий режим с целью повышения эффективности осуществляемых биотехнологических процессов. Среди большого количества разнообразных типов реакторов широкое применение в очистке загрязненных вод получили биореакторы с псевдоожиженным слоем ( fluidized-bed bioreactors ) [9]. Их конструкция позволяет увеличивать время удержания биокатализатора внутри реакторного блока в условиях постоянного водного потока, равномерно распределять жидкость между носителем с закрепленными клетками, избегать значительных перепадов давления по высоте реактора, использовать конструкции небольших размеров, не требует применения дополнительных систем аэрации [ 10, 11 ] . Кроме того, подвижность носителя с иммобилизованными микроорганизмами в водной фазе биореактора с псевдоожиженным слоем обеспечивает более активный, чем в реакторах с неподвижным слоем, теплообмен и массоперенос, что, в свою очередь, приводит к выравниванию температуры по всему объему реактора, возрастанию скорости и увеличению эффективности биотехнологических процессов [ 1 ] .

С целью оптимизации режима работы биореактора применяются математические модели, позволяющие подбирать оптимальные технологические параметры и прогнозировать эффективность микробиологических процессов. Следует отметить, что процессы, протекающие в биореакторах с псевдоожиженным слоем катализатора, являются одними из сложных объектов для математического моделирования. Это связано с тем, что псевдоожиженный слой представляет собой сложную дисперсную систему, в которой возникают самоорганизующиеся коагрегированные частицы [ 7 ] . Кроме того, ограничено число параметров, которые можно измерить непосредственно в биореакторе: плотность носителя, частота колебания плотности частиц, изменение скорости потока по высоте биореактора. Поэтому наиболее часто используемый для описания таких процессов подход основан на получении одномерных временных данных. При этом псевдоожиженный слой катализатора рассматривается как единое целое, где перемешивание частиц по всей его высоте считается идеальным, а их распределение - равномерным [ 4 ] . В данной работе представлены результаты экспериментального и теоретического исследования процесса иммобилизации клеток родококков на твердом органическом носителе – гидрофобизованных хвойных опилках, в биореакторе с псевдоожиженным слоем.

Экспериментальное исследование процесса

ИММОБИЛИЗАЦИИ АКТИНОБАКТЕРИЙ В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ

Для экспериментального изучения процесса иммобилизации актинобактерий использовали колоночный биореактор (рис. 1), рабочие параметры которого приведены в табл. 1.

Рис. 1. Экспериментальная установка для изучения процесса иммобилизации клеток родококков: 1 – суспензия клеток родококков; 2 – перистальтический насос; 3 – колоночный биореактор

Таблица 1

Рабочие параметры колоночного биореактора

Параметр	Значение	Параметр	Значение
Объем биореактора, см3	43,2	Концентрация частиц носителя, –3 мм	0,1
Высота рабочей зоны, см	14	Площадь поверхности частицы, мм2	10
Радиус рабочей зоны, см	0,7	Общая площадь поверхности носителя, см2	55,3
Масса носителя, г	2,0	Концентрация биомассы, кл/мл	2,0·107
Размер частиц носителя, см	0,1–0,3	Соотношение R. ruber : R. opacus	1:1
Скорость подачи бактериальной суспензии, мл/мин	0,6; 1,2; 2,0; 2,8

Биореактор представлял собой стеклянную колонку, заполненную стерильными гидрофобизованными хвойными опилками. Для их поддержания в рабочей зоне использовали расположенный на входе в биореактор фильтр из кварцевого стекла, который также позволял поддерживать однородную структуру носителя без прохождения воздушных пузырьков и снизить их вклад в формирование псевдоожиженного слоя. При помощи силиконовых трубок колонка соединялась с колбой, содержащей суспензию (200 мл) бактерий Rhodococcus ruber ИЭГМ 615 и Rhodococcus opacus ИЭГМ 249 из региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains.html ), взятых в равных соотношениях. Бактериальная суспензия из колбы подавалась в биореактор с помощью перистальтического насоса через нижнюю часть реактора в восходящем направлении и, пройдя через слой носителя, через его верхнюю часть возвращалась обратно в колбу. За счет высокой скорости (1,2–2,8 мл/мин) подачи бактериальной суспензии в биореакторе формировался псевдоожиженный слой, омывающий каждую частицу носителя, в результате чего увеличивалась вероятность адсорбции клеток на их поверхности. ISSN 1812-5123. Российский журнал биомеханики. 2012. Т. 16, № 4 (58): 83–91 85

а

б

Рис. 2. Кинетика иммобилизации актинобактерий на гидрофобизованных опилках в колоночном биореакторе с псевдоожиженным слоем при средней ( а ) и минимальной / максимальной ( б ) скорости подачи бактериальной суспензии, мл/мин:

( о ) - 0,6; ( ◊ ) - 1,2; ( + ) - 2,0; ( □ ) - 2,8. Сплошные линии - теоретические зависимости

Процесс иммобилизации родококков контролировали по изменению показателя оптической плотности (ОП 600 нм ) содержащейся в колбе бактериальной суспензии с помощью двулучевого спектрофотометра Lambda EZ 201 ( Perkin Elmer , США). Отбор образцов проводили ежедневно в течение 7 суток. Все эксперименты осуществляли в трех повторностях.

На рис. 2 точками показано измеренное изменение показателя оптической плотности клеточной суспензии от времени при различных скоростях ее подачи в колоночный биореактор. Как видно из рис. 2, процесс иммобилизации родококков при средней скорости (1,2–2,0 мл/мин) подачи суспензии в биореактор характеризовался равномерным снижением показателя оптической плотности в течение всего периода эксперимента. В то же время при минимальной (0,6 мл/мин) и максимальной (2,8 мл/мин) скорости наблюдалось увеличение контролируемого показателя после 96 и 120 ч эксперимента соответственно. В случае минимальной исследуемой скорости такое увеличение может быть обусловлено коагрегацией бактерий в нижней части биореактора с последующим их вымыванием. Коагрегация клеток вызвана тем, что скорость подачи суспензии 0,6 мл/мин недостаточно высока для формирования псевдоожиженного слоя, в результате этого частицы носителя оставались неподвижными и плотно уложенными, что препятствовало равномерному распределению адсорбирующихся бактериальных клеток между ними. Наблюдаемое повышение показателя оптической плотности суспензии родококков в случае высокоскоростного режима (2,8 мл/мин) работы биореактора может быть обусловлено механическим повреждением и выносом материала носителя из реактора из-за интенсивного движения частиц в псевдоожиженном слое, а также фрагментацией клеточного мицелия, являющейся особенностью морфогенетического цикла родококков.

Для выяснения общих тенденций и закономерностей протекания процесса иммобилизации актинобактерий при заданных значениях скорости подачи бактериальной суспензии в колоночный биореактор проведен теоретический анализ полученных экспериментальных данных методом биомеханического моделирования.

Биомеханический анализ процесса иммобилизации актинобактерий В КОЛОНОЧНОМ БИОРЕАКТОРЕ С ПСЕВДООЖИЖЕННЫМ СЛОЕМ

Представим схематично рабочую зону биореактора в виде цилиндра высотой H (см. рис. 1) и радиусом основания R . В цилиндре располагаются частицы носителя, а в колбе - суспензия клеток родококков, в начальный момент времени находящихся в свободном состоянии. Перистальтический насос прокачивает клеточную суспензию по замкнутому контуру. Обозначим скорость подачи суспензии через ф ; тогда скорость движения жидкости в цилиндре v = фДл R ² ) . Для описания происходящих процессов применим подход, изложенный в работе [ 2 ] .

Учитывая, что с течением времени в биореакторе происходят процессы: (1) иммобилизации свободных клеток, (2) десорбции иммобилизованных клеток с поверхности частиц носителя с их последующим переходом в свободное состояние и (3) распада клеточного мицелия на короткие палочковидные формы, изменение концентрации свободных ( n s ) и иммобилизованных ( n i ) клеток можно записать следующим образом:

dn dt = D(1)(Й^В(2)(й*

VI ns\V) I         s-^ s \l / 1 s—,s \V / 1 s-zs \ I ) , dni (t) / dt = D® (t) + D^ (t) + D® (t),                         (2)

где D sj ) ( t ), D ij ) ( t ) ( j = 1, 2, 3) - скорости изменения соответственно n s ( t ) и n i ( t ) за счет каждого из трех процессов. Найдем D s^j ) ( t ) , D i^j ) ( t ) . Допустим, что за бесконечно малый промежуток времени dt с частицей носителя столкнутся свободные клетки родококков, находящиеся в прилегающем к «одной стороне» частицы слое жидкости толщиной vdt , следовательно, с данной частицей столкнутся Svn s ( t ) dt /2 свободных клеток, где S - площадь поверхности частицы. Обозначим через p ( v ) вероятность иммобилизации свободной клетки при ее столкновении с частицей носителя. Тогда за промежуток времени dt количество свободных клеток уменьшится на ( Svn s ( t ) dt / 2) p ( v ) n c n R ² H , где n_c - концентрация частиц носителя. Отсюда следует, что

D11,l( t) = - Svns (t) p (v) nc/2.(3)

Очевидно, что

D,(l|( t) = - d<«( t).(4)

Пусть вероятность десорбции иммобилизованной клетки за промежуток времени dt равна dt / T _d ( v ), где T d ( v ) - среднее время, за которое клетка будет десорбирована от частицы носителя; тогда

DS2'( t) = n( t)/Td (v),(5)

Dp’( t) = - Dp\ t).(6)

Будем считать, что D ^ ³) ( t ), D ^ -³^ ( t ) пропорциональны соответственно концентрациям ⁿ s ⁽ t ) ^{и n} i ⁽ t ^):

Ds(3)(t) = a(t)ns (t),

D<3)( t) = a( t) n (t),(8)

ISSN 1812-5123. Российский журнал биомеханики. 2012. Т. 16, № 4 (58): 83-9187

где коэффициент a(t) выбирается из следующих соображений. Пусть из трех перечисленных выше процессов имеет место только процесс распада клеточного мицелия; тогда из (1) и (7) следует, что ns (t) = ns (0)exp |а(т)dт и аналогично для

ni (t). Будем считать, что процесс распада мицелия, сопровождающийся увеличением числа клеток, происходит по закону ns (t) = ns (0) • (K(v) - (K (v) - 1)exp(-11 Tf (v))), где K > 1 - кратность распада, Tf - характерное время распада. Тогда

При t = 0 иммобилизованные клетки отсутствуют, а концентрация свободных клеток равна начальному значению n_s о . Тогда, подставляя (3)-(8) в (1) и (2), получим следующую задачу Коши для кинетических уравнений относительно функций n_s ( t ) и n i ⁽ t ^):

dns(t) / dt = - ns(t) / T (v) + n (t) / Td (v) + a( t, v) ns(t), dni (t) / dt = ns (t) / T (v) - ni (t) / Td (v) + a( t, v) ni (t), ns (0) = ns 0, ni (0) = 0, где

T (v) = 2/ (Sncvp (v)).(11)

Из (10) и (9) находим ns(t) = ^т.ns0№ , x(Ti(v)/Td(v) + exp(-(VTi(v) +1 Td(v))t))x 1+T(vVTd(v г

x( K (v) - (K (v) - 1)exp (-t/Tf (v))).(12)

Из (10) можно найти теоретическое значение степени иммобилизации d клеток родококков: d = n i ( +да )/( n i ( +ю ) + n _s ( +« )) = T _d / (T _d + T ). Кроме того, зная T ( v ), из уравнения (11) можно найти p ( v ).

Оценим теперь зависимость n_s и n i от точки пространства, т.е. от координаты z (см. рис. 1): n_s ( z , t ) и n i ( z , t ). Пусть из упомянутых выше трех процессов происходит только иммобилизация свободных клеток. Тогда значение n _s ( z , t + dt ) определяется переносом свободных клеток из точки с координатой z - vdt и иммобилизацией свободных клеток в точке с координатой z (см. (1)):

ns (z, t + dt) = ns (z - vdt, t) - D^1 dt,(13)

где (см. (3), (11))

D1^ =-ns(z,t)/Ti.(14)

Из (13), (14) находим

5ns I dt + vdns I dz + ns I Ti = 0 .(15)

Пусть в начальный момент времени в цилиндре не было свободных клеток, а из колбы поступает клеточная суспензия с постоянной концентрацией ns0 свободных клеток. Тогда ns (z ,0) = 0 при 0 < z < H , ns (0, t) = ns о при t > 0.               (16)

Решение уравнения (15) с дополнительными условиями (16) имеет вид ns(z, t) =

<

ⁿ s 0 exp( - ^z /(vT i ))

при 0 <  z <  vt ,

при z >  vt .

Так как в рассматриваемом случае dni / dt = ns / T (см. (10)) и ni- (z,0) = 0 при 0 < z < H, то из (17) находим ni(z, t) =

n s 0 ⁽ t - ^z / ^{v )ex}P⁽ - ^z ( vT))

при 0 <  z <  vt ,

при z >  vt .

Из (17) и (18) следует, что если H(vvT i ) « 1 и t » H/v , то n s ( z , t ) и n i ( z , t ) слабо зависят от z . Из табл. 2 (см. ниже) следует, что H(vvT i ) ~ 0,0 1 и первое из выписанных выше неравенств выполнено. Поскольку H/v ~ 36 мин, а измерения продолжаются 7 сут., то второе из выписанных выше неравенств выполнено в течение практически всего промежутка измерений. Таким образом, вполне правомерно пренебречь зависимостью n_s и n_i от z , как это и сделано выше. Следует, однако, заметить, что при t ~ H/v неравномерность распределения n i по z наблюдается экспериментально по изменению цвета содержимого цилиндра.

Сопоставление экспериментальных и теоретических данных

Теоретическая формула (12) сопоставлялась с экспериментально измеренными значениями n s ( t ) (в единицах ОП _{600 нм}, рис. 2) в диапазоне значений ф от 0,6 до 2,8 мл/мин. В формуле (12) n s q = 1ОП 6_ООнм , а параметры T i , T d , K и T f находились методом наименьших квадратов. При этом получено, что K = 1 (не обнаруживается распада клеток), и тогда значение T_f определить невозможно. Найденные значения T_i и T d приведены в табл. 2. Величина p вычислена по формуле (11), где S = 10 мм², n c = 0,1 мм ^{- 3} (см. табл. 1). Соответствующие теоретические кривые показаны на рис. 2.

Как видно из рис. 2, теоретические зависимости показателя оптической плотности от времени качественно совпадают с экспериментальными данными.

Таблица 2

Теоретически найденные параметры процесса иммобилизации

φ, мл/мин	0,6	1,2	2,0	2,8
T i , ч	49	210	73	41
T d , ч	40	140	73	53
p	1,8∙10–4	2,1∙10–5	3,5∙10–5	4,5∙10–5

Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная модель адекватно описывает основные черты протекания иммобилизационного процесса и допускает дальнейшее развитие, которое может состоять в теоретическом описании ряда вышеупомянутых явлений, приводящих к немонотонностям в исследуемых зависимостях.

Заключение

Проведено экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации актинобактерий на твердом носителе при различных скоростях подачи бактериальной суспензии в колоночный биореактор. Установлено, что рассчитанные на основе математической модели показатели n_s ( t ) для четырех исследуемых скоростей подачи клеточной суспензии в биореактор согласуются с экспериментальными данными. Разработанная модель является перспективной и допускает дальнейшее развитие, которое может заключаться в учете большего количества экспериментальных данных и в более детальном исследовании функций n_s ( z , t ) и n_i ( z , t ).

Благодарности

Исследования поддержаны грантами Министерства образования и науки РФ (ГК 16.518.11.7069) и Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052).