Экспериментальное изучение особенностей формирования парагемолитическими вибрионами биопленки на поверхностях биотических объектов

Ежегодно в мире вылавливается и потребляется свыше 100 млн т морепродуктов [Cisneros-Montemayor et al., 2016], которые являются скоропортящимися и представляют опасность для здоровья из-за загрязнения патогенами [Reyhanath,

Kutty, 2014]. Поэтому безопасность морепродуктов важна для поддержания здоровья населения.

Наиболее распространенными патогенами, встречающимися на морепродуктах (креветки, рыба, моллюски) и способными вызвать серьезные заболевания у людей, являются парагемолитиче-ские вибрионы [Lee, Liu, Huang, 2003; Беленева,

Масленникова, Магарламов, 2004; Lin, Yu, Chou, 2004; Park et al., 2004; Тарасенко др., 2016]. Занимая различные экологические ниши, V. parahaemolyticus, благодаря наличию одного полярного жгутика, может существовать в воде в планктонной форме или же быть прикрепленным к инертным частицам, таким как взвешенные частицы, зоопланктон, рыбы, моллюски и ракообразные [Скитович, Шадрова, Прунтова, 2015].

Употребление морепродуктов, зараженных V. parahaemolyticus, приводит к вспышкам болезней пищевого происхождения (Китай, Австралия, Индонезия, Россия), протекающим по типу пищевой токсикоинфекции. Кроме того, парагемолитиче-ские вибрионы могут быть причиной заболеваний не только пищевого характера людей. Известны случаи инфицирования ран, ушей, связанные с пребыванием в морской воде; имеются сообщения о пневмонии, септицимии, хроническом посттравматическом отите, вызванном V. parahaemolyticus [Бойко, 1994; Deepanjali et al., 2005; Zhang, Orth, 2013; Shaw et al., 2014; Elmahdi, DaSilva, Parveen, 2016].

Непосредственное заражение человека от воды – явление редкое, так как парагемолитические вибрионы, в первую очередь, встречаются в морской воде, которая для питьевых целей не употребляется. В тех же количествах морской воды, которые попадают в организм человека при купании, видимо, не содержится того количества возбудителя, которое могло бы вызвать заболевание. Этим и следует объяснить единичность сообщений о заболеваниях, связанных с водными заражениями человека бактериями V. parahaemolyticus . Однако такую возможность нельзя исключать, учитывая вспышку диареи в г. Абиджан (Кот-д'Ивуар) в 1987 г., обусловленную V. parahaemolyticus и связанную с употреблением воды из лагуны, которая продолжались 8 недель и охватила 84 человека [Хотько, Дмитриев, 2002]. Были зарегистрированы случаи выделения парагемолитических вибрионов и в пресноводных водоемах [Бойко, 1994; Chakraborty, Nair, Shinoda, 1997]. Возможны случаи вторичного инфицирования овощных продуктов при обработке их водой, содержащей V. parahaemolyticus .

На протяжении большей части истории микробиологии микроорганизмы в основном характеризовались как планктонные, свободно взвешенные клетки и описывались на основе их характеристик роста в питательно богатых культуральных средах. Впервые микробиологический феномен того, что микроорганизмы прикрепляются и растут на поверхностях, описал Э. ван Левенгук, увидев микроорганизмы на поверхности зубов, еще в конце XVII в. Достижения технологии электронной микроскопии привели к обнаружению структурных поверхностно-ассоциированных организованных микроорганизмов, заключенных во внеклеточную матрицу полимерного вещества – биопленок [Donlan, 2002].

Биопленка представляет собой совокупность микробных клеток, которые необратимо связаны (не удаляются путем мягкого ополаскивания) с поверхностью и заключены в матрицу преимущественно полисахаридного материала и могут образовываться на самых разных поверхностях, таких как живые ткани, медицинские изделия, трубопроводы [Шварц, 2015]. Граница раздела фаз «твердое вещество-жидкость» обеспечивает идеальную среду для прикрепления и роста микроорганизмов. Отмечено, что степень микробной колонизации увеличивается по мере увеличения шероховатости поверхности, что связано с большей площадью прикрепления [Characklis, McFeters, Marshall, 1990]

Способность бактерий к формированию биопленок приводит к тому, что биопленочные штаммы демонстрируют множественную лекарственную устойчивость [Ahmed et al., 2018], устойчивость к дезинфектантам [Song et al., 2017], что представляет собой потенциальную угрозу для здоровья человека. Формируя биопленки, микроорганизмы могут быть в 1000 раз более устойчивыми к стрессу, чем планктонные формы [Brooun, Liu, Lewis, 2000; Ashrafudoulla et al., 2019], сохраняя при этом способность к заражению, что демонстрирует важность изучения биопленкообразования у болезнетворных микроорганизмов. Опасность заключается также в том, что наблюдается широкое распространение морепродуктов по всей стране из городов, занимающихся рыбным промыслом, что может привести к возникновению заболевания в случае инфицированности их вибрионами в городах, не являющихся прибрежными и не имеющими прямого контакта с морем [Mizan et al., 2016].

Согласно МУК 4.2.2046-06, по эпидпоказаниям на V. parahaemolyticus исследуют пищевые продукты, воду открытых водоемов, гидробионтов. Способность к формированию биопленок требует дополнительного изучения в плане определения объектов, способствующих накоплению возбудителя и требующих внимания при проведении микробиологических исследований.

Так как парагемолитические вибрионы выделяются как из воды поверхностных водоемов, так и из гидробионтов, целью нашей работы явилось изучение особенностей формирования биопленки бактериями вида V. parahaemolyticus на поверхностях биотических объектов для дальнейшего совершенствования алгоритма исследования на га-лофильные вибрионы в зонах рекреации на этапе отбора проб.

Материалы и методы исследования

Материал для исследования

В работе были исследованы штаммы V. рa-rahaemolyticus , характеристика которых приведена в табл. 1. Штаммы имели как природное, так и клиническое происхождение и различались по наличию основного фактора патогенности параге-молитических вибрионов – гена tdh – прямого термостабильного гемолизина V. parahaemolyticus . Все штаммы были получены из коллекции Музея живых культур с Центром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ Ростовский противочумный институт Роспотребнадзора.

Таблица 1

Характеристика штаммов, использованных в работе

№ штамма	Генетическая характеристика	Объект выделения	Место и год выделения
13331	tdh+ trh-	человек	Япония, 1971
14704	tdh- trh-	рыба	Азовское море, 1984
14810	tdh+ trh-	человек	г. Новороссийск, 1976
16696	tdh- trh-	морская вода	г. Новороссийск, 1973
19013	tdh+ trh-	человек	г. Бердянск, 1988
19149	tdh- trh-	морская вода	г. Находка, 2009

Методы исследования

Питательные среды . Для культивирования штаммов использовали 1%-ную пептонную воду с 2%-ным NaCl (рН 7.8); 2%-ный агар Мартена с 2%-ным NaCl (рН 7.7); 0.3%-ный агар Мартена с 2%-ным NaCl (рН 7.7).

Биотические субстраты . В качестве субстратов использовали чешую рыбы и хитиновый экзоскелет креветки, которые нарезали пластинами 5×5 мм, помещали в количестве 30 штук во флаконы с 50 мл морской воды и автоклавировали при 130ºС, 1.5 атм в течение 60 мин.

Выращивание биопленки. Из суточной агаровой культуры штаммов V. parahaemolyticus готовили взвесь 109 микробных клеток/мл (мк.кл./мл). Во флаконы с 50 мл морской воды и субстратами добавляли взвесь вибрионов до конечной концентрации во флаконе 104 мк.кл./мл. Параллельно проводили высев на твердую питательную среду для определения КОЕ/мл. В качестве контроля все исследуемые штаммы засевали во флаконы с 50 мл морской воды без субстратов. Флаконы инкубировали в течение 1 месяца при комнатной температуре (t = 25±2ºС), что соответ- ствует температурным условиям окружающей среды в летнее время года.

Бактериологические методы . Для контроля жизнеспособности штаммов V. parahaemolyticus использовали метод бактериологического посева супернатантов и отпечатков субстрата на твердую питательную среду – агар Мартена с 2%-ным NaCl [Титова, Веркина, 2016]. Результат оценивали по наличию роста.

Микроскопия . Образцы пластинок субстратов (чешуи и хитина) с сформировавшейся биопленкой окрашивали 0.1%-ным водным раствором Конго красным по методике, предложенной С.В. Титовой и Л.М. Веркиной [2016]. Микроскопию проводили на микроскопе Nicon Eclipse E200 (Japan).

Real-Time ПЦР . Для проведения ПЦР в «реальном времени» отбирали по 0.3 мл из контрольных проб. Фрагменты хитина и чешуи стерильно трижды отмывали физиологическим раствором (рН 7.2) от несвязавшихся клеток, избавлялись от излишков влаги с помощью фильтровальной бумаги и помещали в 0.3 мл дистиллированной воды. Также отбирали по 0.3 мл проб планктонных микроорганизмов. Все пробы обеззараживали прогреванием при 100ºС в течение 30 мин., согласно руководству [Организация …, 2010].

Для проведения Real-Time ПЦР с количественным учетом результатов использовали сконструированные нами праймеры и зонд к гену металло-протеазы/коллагеназы V. parahaemolyticus [Рыков-ская и др., 2018]. Постановку реакции амплификации проводили в автоматическом детектирующем амплификаторе ДТ-Lite (ДНК-технология, Россия). Учет детекции флуоресцентного свечения проводили по каналу ROX с длиной волны 605 нм.

Результаты и их обсуждение

Для проведения Real-Time ПЦР в протокол исследования проб были включены образцы с известным количеством искомой ДНК – калибровочные стандарты, в качестве которых использовали взвеси суточных культур парагемолитических вибрионов с концентрацией клеток 109–102 м.кл./мл. Количество клеток взвесей определяли путем высева на чашки Петри и подсчета КОЕ. Программа проводит построение кривой линии по точкам калибровочных стандартов, в соответствии с которой проводится расчет концентрации исследуемых проб.

Отбор проб для постановки Real-Time ПЦР и бактериологического высева на питательные среды проводили ежедневно в течение 7 дней, затем один раз в неделю в течение 1 месяца.

В течение первых 3 сут. культивирования отме- чался активный рост парагемолитических вибрионов во всех испытуемых пробах, но степень роста была разной. Так, наименьшей скоростью роста характеризовались штаммы в контрольных флаконах с морской водой. Штаммы, культивируемые в морской воде с биотическими субстратами, имели более высокую скорость роста, что подтверждалось и бактериологическим методом путем подсчета КОЕ/мл, и методом Real-Time ПЦР при определении количества копий ДНК в течение всего периода наблюдения. Слабый рост в контрольных пробах с морской водой, по сравнению с планктоном над хитиновыми пластинками и чешуей, говорит о недостатке питательных веществ и использовании вибрионами биотических субстратов в качестве источника питания.

Через 72 ч. культивирования было отмечено, что штаммы парагемолитических вибрионов, не имеющие гена tdh , образуют на поверхности морской воды с хитином и чешуей довольно плотную пленку, в отличие от токсигенных штаммов, у одного из которых пленка визуально отсутствовала ( V. parahaemolyticus 19013), а у двух других была значительно менее выражена, чем у штаммов, выделенных из объектов окружающей среды.

К 14-м сут. наблюдения пленка на поверхности жидкости во флаконе с пластинками хитина и чешуей увеличилась и стала более плотной. В контрольных пробах при визуальном учете на поверхности раздела фаз «вода-воздух» все штаммы независимо от токсигенности и происхождения биопленки не образовывали на протяжении всего периода наблюдения.

Изучение особенностей роста и формирования биопленок на поверхности субстратов показало, что парагемолитические вибрионы по-разному проявляют себя на хитине и на чешуе рыб. Так, на 6-е сутки культивирования, при отборе пластинок субстратов было отмечено, что клинические токси-генные штаммы в процессе жизнедеятельности утилизируют пластинки чешуи, в результате чего они становятся рыхлыми и при прикосновении к ним распадаются. Согласно литературным данным, чешуя рыб содержит 39–68% азотистых веществ (щелочерастворимых, водорастворимых и солерастворимых белков), 27–49% минеральных веществ (кальций, фосфор, магний и др.), 0.1–0.2% жира. Основная доля белков чешуи приходится на коллаген – 48–59%. Вибрионы способны активно вырабатывать фермент коллагеназу, что объясняет использование чешуи в качестве источника питательных веществ для роста и размножения микробных клеток [Якубова, Котенко, 2004; Антипова, Ву Тхи Лоан, 2009; Као, Нгуен, Карапун, 2016]. Динамика формирования биопленок штаммами поверхностных водоемов представлена на рис. 1.

Время культивирования, сутки

Рис. 1 . Динамика изменения количества копий ДНК при выращивании на пластинках чешуи

Столь активное использование рыбьей чешуи в качестве источника питания для роста и размножения парагемолитических вибрионов приводит к выводу о ее возможном применении в качестве основы для приготовления питательных сред. Учитывая, что чешуя является отходом рыбного производства, который образуется в большом количестве, возможное использование ее для приготовления питательных сред привело бы к снижению затрат на их производство.

Данные количественного ПЦР-анализа свидетельствуют о том, что образование биопленки на хитиновом панцире креветок шло активнее, чем на чешуе рыб (рис. 2). Панцирь креветки, по разным данным, состоит из белка – 7–37%, липидов – 3– 5%, углеводов – до 13%, минеральных веществ – до 22% [Осовская и др., 2010; Муравьев, 2017; Аллам, 2018]. Количество хитина составляет от 5– 25%. Хитин панциря креветок Penaeus semisulcatus может быть использован в качестве источника хитина и хитозана [Аллам, 2018].

Рис. 2. Динамика изменения количества копий ДНК при выращивании на пластинках хитина

Поскольку хитин имеет компактную структуру, он нерастворим в большинстве растворителей, его биодоступность для микроорганизмов предположительно является невысокой, что объясняет меньшие темпы роста бактерий V. parahaemo-lyticus в планктоне с хитином. Однако наличие большого количества других питательных веществ позволяет микроорганизмам активнее размножаться в сравнении с контрольными флаконами с морской водой, где отсутствуют какие-либо питательные субстраты. Это согласуется с количественными результатами Real-Time ПЦР, согласно которым нарастание количества копий ДНК наиболее активно идет именно в планктоне над чешуей и хитином.

При культивировании контрольных проб с морской водой в течение 72 ч. методом Real-Time ПЦР было показано, что во всех пробах количество копий ДНК увеличивалось (рис. 3). На 6-e сутки инкубирования количество копий ДНК парагемоли-тических вибрионов значительно снизилось, что, учитывая отсутствие каких-либо питательных веществ в морской воде, может свидетельствовать о том, что ДНКаза вибрионов расщепляет ДНК клеток, и продукты расщепления используются для выживания других клеток [Беленева, Масленникова, Магарламов, 2004]. Такая же закономерность прослеживается и при изучении планктонных форм микроорганизмов из проб, содержащих пластинки чешуи и хитина.

Рис. 3. Динамика изменения количества копий ДНК при выращивании в морской воде

Через 27 сут. культивирования ПЦР анализ показал, что количество копий ДНК в контрольной и планктонных пробах стало менее 10³ в мл. При этом в биопленочных пробах количество копий ДНК V. parahaemolyticus было 10⁴–10⁶.

Таблица 2

Отношение количества копий ДНК планктонной формы к биопленочной

№ штамма	Субстрат	24 ч.	48 ч.	72 ч.	16 сут.
13331	чешуя	2583	-	-	-
	хитин	1108	13.6	0.2	1.1
14704	чешуя	143.6	58.5	36.5	-
	хитин	150.2	0.03	0.7	0.3
14810	чешуя	59.6	156.1	10	-
	хитин	40.8	40.8	0.02	-
16696	чешуя	15056	5841	457.4	3,7
	хитин	15.7	-	-	-
19013	чешуя	1891	4615	802.6	-
	хитин	1360	8943	476.3	0.2
19149	чешуя	169.7	450.6	51.9	-
	хитин	3.2	5.6	4.8	0.2

Было установлено, что через 24 ч. инкубирования соотношение планктонной формы к биопле-ночной максимально независимо от наличия генов токсигенности и происхождения штаммов, т. е. в этот период времени количество копий ДНК в планктоне выше, чем в биопленке (табл. 2), и формирование биопленки находится на начальном этапе. Через 48 ч. у трех штаммов (14810, 19013 и 10149) соотношение биопленочной и планктонной форм продолжало расти, а у трех штаммов снизилось. К 16 дню инкубирования у всех штаммов данное соотношение значительно снизилось (у штамма V. parahaemolyticus 16696 в 4000 раз), что свидетельствует о том, что большая часть планктонных штаммов перешла в биопленочную форму для переживания неблагоприятных условий (снижение питательных веществ и отравление продуктами собственной жизнедеятельности).

Выводы

• 1.    Утилизация парагемолитическими вибрионами в качестве питательных веществ компонентов чешуи и хитина способствует образованию биопленки и интенсивному размножению на биотических поверхностях.

• 2.    Высокую концентрацию жизнеспособных клеток парагемолитических вибрионов в биопленке на поверхности биотических субстратов следует учитывать при выборе объектов исследования на наличие V. parahaemolyticus , особенно в зонах рекреации.