Экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства
Автор: Дудчик Н.В., Филонюк В.А., Шевляков В.В., Сычик С.И., Нежвинская О.Е.
Журнал: Анализ риска здоровью @journal-fcrisk
Рубрика: Экспериментальные модели и инструментальные исследования для оценки риска в гигиене и эпидемиологии
Статья в выпуске: 3 (19), 2017 года.
Бесплатный доступ
Научное обоснование и практика гигиенического и экологического нормирования биологических факторов среды обитания имеют ряд принципиальных особенностей и в методическом плане разработаны меньше, чем нормирование химических факторов. Эффективный производственный контроль предельно допустимых концентраций нормированных микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны основан на использовании валидированных инструментальных методов количественной оценки. Целью работы являлось экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов многокомпонентного микробного препарата в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства, а также разработка методики выполнения измерений в воздухе рабочей зоны концентрации Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3. Обоснована технология количественного определения микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны в модельном эксперименте, основанная на классических этапах и приемах микробиологической практики: отбор проб воздуха аспирационным способом с учетом отобранного объема, культивирование в оптимальных для изучаемых микроорганизмов-продуцентов условиях на питательной среде приведенного состава, подсчет сформированных колоний с характерными морфологическими признаками, морфологическая идентификация микроорганизмов и колоний, расчет количества микроорганизмов на чашках с перерасчетом на 1 м3 воздуха. На основании установленных закономерных концентрационных зависимостей динамики микробной контаминации в воздушной среде разработана методика количественного определения микроорганизмов-продуцентов, выполнена метрологическая оценка операционных характеристик для оценки микроорганизмов-продуцентов многокомпонентного микробного препарата как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства. Проведена валидация методики выполнения измерений в соответствии с требованиями Международной организации по стандартизации (ИСО).
Биологический фактор, модельный эксперимент, микроорганизмы-продуценты, многокомпонентные микробные препараты, методики выполнения измерений, концентрация микроорганизмов-продуцентов, воздух рабочей зоны, операционные характеристики, гигиенические нормативы, биотехнологическое производство
Короткий адрес: https://sciup.org/14238017
IDR: 14238017 | УДК: 612.017.3: | DOI: 10.21668/health.risk/2017.3.15
Experimental modeling of aerosols produced by microorganisms in working area air as risk factor exerting hazardous impacts on health of workers employed at biotechnological production
Scientific foundation and practices in the sphere of hygienic and ecological standardization concerning biological factors of the environment have a number of peculiarities and are methodically less developed than chemical factors standardization. Efficient industrial control over maximum permissible concentrations of standardized microorganisms-producers in working area air is based on validated instrumental techniques of quantitative assessment. Our goal was to create experimental models for microorganisms-producers' aerosols of a multi-component microbe specimen in working area air as a risk factor causing impacts on health of workers employed at biotechnological production; another task was to work out a procedure for measuring Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17concentration and cells and spores of Bacillus sp. BB58-3 strain in working area air. We gave grounds for a technology aimed at quantitative determination of microorganisms-producers in working area air in a modeling experiment; it was based on conventional stages and techniques accepted in microbiological practices, namely air samples taking via aspiration technique allowing for a volume taken; cultivation under conditions which are optimal for examined microorganisms-producers in a nutrient medium with reduced composition; calculation of evolved colonies with specific morphological features; morphologic identification of microorganisms and colonies; calculation of microorganisms' quantity on dishes with recalculation per 1 m3 of air. Basing on the detected regular concentration dependences of microbe contamination dynamics in air we worked out a procedure for quantitative determination of microorganisms-producers; we also performed metrological estimate of operational properties for assessing microorganisms-producers of a multi-component microbe specimen as a risk factor causing hazardous impacts on health of workers employed at biotechnological production. We validated our measuring procedure in conformity with the requirements set forth by ISO.
Текст научной статьи Экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства
(МП) возможно загрязнение ими производственной среды, выделение в воздух рабочей зоны и атмосферы веществ с вредным воздействием на здоровье работников и населения [2, 3, 6, 9, 12, 13, 14]. В промышленных условиях наличие МО в воздухе рабочей зоны, непосредственный контакт с микробными аэрозолями в процессе использования могут являться факторами риска здоровью работников биотехнологических производств, поскольку промышленные штаммы МО малопатогенны, но обладают сильной или выраженной сенсибилизирующей способностью (1–2-й класс аллергенной опасности) [13, 14].
Поэтому актуальным и практически значимым является изучение свойств микроорганизмов и оценка опасности и вероятности неблагоприятных для здоровья человека последствий производства биотехнологической продукции, содержащей жизнеспособные клетки и их структурные элементы, эффективная медицинская профилактика их вредного действия, гигиеническое нормирование и контроль за их содержанием в объектах среды обитания человека. Научное обоснование и практика гигиенического и экологического нормирования биологических факторов среды обитания имеют ряд принципиальных особенностей и в методическом плане разработаны меньше, чем химических факторов. В Республиканском унитарном предприятии «Научно-практический центр гигиены» Министерства здравоохранения Республики Беларусь разработка методологии и методов гигиенического регламентирования и нормирования МО и МП как биологических факторов среды обитания человека является одним из ведущих научных направлений, сформирована научная школа в данном, как мы считаем, перспективном, направлении профилактической медицины. В результате выполненных комплексных токсиколого-гигиенических исследований проведено гигиеническое регламентирование более 100 МО и МП, установлены предельно допустимые концентрации (ПДК) в воздухе рабочей зоны 12 новых одно- и многокомпонентных МП [1, 3, 5–8, 10, 11].
Эффективный производственный контроль ПДК нормированных МО и МП в воздухе рабочей зоны основан на использовании валидированных инструментальных методов количественной оценки.
Разработка стандартизованных и валидированных методик выполнения измерений (МВИ) концентраций МП и МО в воздухе рабочей зоны представляет собой достаточно сложную анали- тическую задачу, так как экспериментальное моделирование микробных аэрозолей включает оптимизацию всех параметров инструментального метода (условий отбора проб воздуха при различной микробной нагрузке, культивирования и идентификации МО и др.), определение аналитических характеристик, связанных со специфичностью и селективностью, концентрационных зависимостей и пределов чувствительности разрабатываемого метода. Методические приемы и алгоритмы расчета операционных характеристик разработаны для таких матриц, как водные среды, пищевые продукты, и отсутствуют для оценки метрологических параметров измерений биологического фактора воздушной среды [6, 7].
Целью работы являлось экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов многокомпонентного микробного препарата в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства, а также разработка методики выполнения измерений в воздухе рабочей зоны концентрации Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3.
Материалы и методы. Объектом исследования являлся новый МП «Профибакттм-Фито» на основе клеток Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3, разработанный государственным научным учреждением «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси».
В работе использовали систему для создания жидких аэрозолей в затравочных камерах объемом 250 л («Спектролаб», РФ); аспиратор SAS SUPER100 (PBI International, Италия), а также стандартное оборудование микробиологических лабораторий. Средства измерений и основное оборудование были должным образом проверены и калиброваны.
В работе использовали селективную среду следующего состава: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; кальций хлористый безводный – 0,02 г; агар микробиологический – 15 г. Для приготовления рабочих разведений МП использовали фосфатный буферный раствор с 0,1%-ным пептоном, рН 7,0. Подтверждение содержания микробных клеток в рабочей культуре проводили путем высева на селективную агаризованную среду приведенного состава. Для оптимизации параметров отбора проб и определения рабочих характеристик детектора (контактные чашки Петри с соответствующей пита- тельной средой) использовали рабочее разведение 106 КОЕ/мл препарата.
На последующих этапах экспериментального моделирования микробного аэрозоля в затравочной камере проводили отбор проб воздуха в диапазоне объемов 10–50 л. Пробы воздуха отбирали аспирационным методом на поверхность агаризованной селективной среды указанного состава в двух повторностях, инкубировали в течение (48 ± 2) ч при (30 ± 0,5) °С и производили подсчет выросших типичных колоний МО. Оценивали культурально-морфологические особенности сформированных колоний и подсчитывали число типичных колоний.
Расчет концентрации МО, КОЕ/м3, производили по формуле:
Х = ( N · 1000) / V , (1)
где Х – концентрация микробных клеток и спор в воздухе рабочей зоны; N – количество колоний МО на чашке; 1000 – коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V – объем отобранной пробы воздуха, дм3.
Результаты и их обсуждение. МО родов Bacillus и Pseudomonas применяются для биологического стимулирования роста и развития сельскохозяйственных культур, а также в качестве средства биологической защиты (табл. 1).
Гигиенические нормативы содержания в воздухе рабочей зоны (ПДК) установлены для МП на уровне 5000 КОЕ (микробных клеток) /м3 по Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp . BB58-3, IV класс опасности [8].
Разработанная технология количественного определения МО в воздухе рабочей зоны в модельном эксперименте основана на классических этапах и приемах микробиологической практики: отбор проб воздуха аспирационным способом с учетом отобранного объема, культивирование в оптимальных для изучаемых МО условиях на питательной среде приведенного состава, подсчет сформированных колоний с характерными морфологическими признаками, морфологическая идентификация микроорганизмов и колоний, расчет количества микроорганизмов на чашках с перерасчетом на 1 м3 воздуха.
На созданной модели распыления в затравочных камерах объемом 250 л установки ингаляционного моделирования жидких аэрозолей отработаны режимы создания диапазона концентраций МО в замкнутом объеме с использованием различных типов распылителей, при разных скоростях подачи на эжекторы и на распылители потока воздуха, экспозициях распыления МП. Оптимизированы параметры аспирационного способа отбора проб воздуха (время и объем) при разных уровнях микробной нагрузки, проведена оптимизация состава сред и режимов культивирования МО с их последующей идентификацией. Полученный массив экспериментальных данных позволил выявить характер и закономерности роста МО в зависимости от концентрации МП в фиксированном объеме затравочной камеры. Характер зависимости между количеством колоний на чашке и отобранным объемом воздуха носил линейный характер и описывался приведенным на рисунке уравнением. Коэффициенты детерминации R² находились в диапазоне 0,93–0,96, что свидетельствует о высокой достоверности полученных результатов количественного определения концентраций МО в воздухе рабочей зоны (рисунок).
Таблица 1
Характеристика МП «ПрофибактТМ-Фито»
|
Источник получения штаммов-продуцентов |
Морфологические, культуральные и биохимические признаки штаммов |
|
Bacillus sp. BB58-3 получен в результате индуцированного мутагенеза природного штамма, антагонист фитопатогенных грибов, не фитотоксичен, стимулирует рост растений |
Неподвижные грамположительные спорообразующие прямые палочки с округлыми концами, размером 0,6 х 3-4 мкм. Колонии мелкие (1,0-3,0 мм) округлые, плосковыпуклые с ровными лопастными краями, кремового цвета, непрозрачные, с неоднородной внутренней структурой. Каталазоположителен, термоустойчив, облигатный аэроб, обладает протеолитической и амилолитической активностью |
|
Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 – получен путем многоступенчатого мутагенеза природного штамма |
Подвижные, грамотрицательные, прямые палочки с округлыми концами, размером 0,6 х 2-3 мкм, с 2-4 монополярными жгутиками. Гладкие, плоские, круглые с ровными краями колонии размером 2–3 мм, желтовато-оранжевого цвета, с однородной внутренней структурой, облигатный аэроб, синтезируют антибиотики феназинового ряда. В качестве азота утилизирует соли аммония, мочевину и нитраты |
Рис. Динамика роста штаммов-продуцентов Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp. BB58-3 в модельном эксперименте
Операционные характеристики для проведения метрологической аттестации МВИ были оценены в соответствии с требованиями Меж- дународной организации по стандартизации (ИСО): определение показателей прецизионности (повторяемость и промежуточная прецизионность с изменяющимся фактором «оператор»), расширенной неопределенности и иных операционных характеристик, а также присущих для оценки биологических факторов показателей специфичности, чувствительности, частоты ложноположительных и ложноотрицательных результатов и др. [8, 11]. На основе массива данных, полученных в модельном эксперименте, были оценены операционные характеристики методов, проведена метрологическая аттестация и утверждены МВИ концентрации МО в воздухе рабочей зоны [5]. В табл. 2 представлены метрологические характеристики и показатели специфичности и селективности разработанных методик.
Таблица 2
Метрологические характеристики и показатели специфичности и селективности методики
|
Метрологические характеристики. Показатели специфичности и селективности |
Тип оценки |
Значение |
|
|
Pseudomonas aurantiaca B-162/255.1 |
Bacillus sp. BB58-3 |
||
|
Взвешенное совокупное относительное стандартное отклонение подсчета ( S z ) |
A |
0,052 |
|
|
Стандартное отклонение повторяемости ( S r ) |
A |
0,012 log 10 КОЕ/м3 |
|
|
Предел повторяемости ( r ) |
А |
0,034 log 10 КОЕ/м3 |
|
|
Стандартное отклонение промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) ( S l ( O ) ) |
A |
0,147 log 10 КОЕ/м3 |
|
|
Предел промежуточной прецизионности ( r l ( O ) ) |
А |
0,41 log 10 КОЕ/м3 |
|
|
Расширенная неопределенность ( k = 2) ( U ) |
A |
0,30 log 10 КОЕ/м3 |
|
|
Чувствительность |
A |
1,0 |
0,96 |
|
Специфичность |
A |
0,8 |
0,6 |
|
Частота ложноположительных результатов |
A |
0,038 |
0,074 |
|
Частота ложноотрицательных результатов |
A |
0 |
0,25 |
|
Селективность |
A |
1,415 |
1,431 |
|
Эффективность |
A |
0,97 |
0,93 |
|
Верхний предел линейности |
A |
Не более 150 типичных колоний на чашку при общем числе колоний не более 300 |
Не более 150 типичных колоний на чашку при общем числе колоний не более 300 |
Выводы. В результате выполненного экспериментального моделирования аэрозолей многокомпонентного МП в воздушной среде получены зависимости содержания МО на последовательных этапах эксперимента и разработан количественный метод их оценки. Оценены операционные характеристики метода определения штаммов Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp. BB58-3 в воздушной среде, разработана аттестованная Белорусским государственным институтом метрологии МВИ концентраций МП в воздухе рабочей зоны. Использование МВИ в рам- ках области аккредитации микробиологических лабораторий обеспечивает объективный санитарно-производственный контроль содержания данных МП в производственной среде на соответствие их ПДК. Научно обоснованные унифицированные подходы разработки МВИ концентраций многокомпонентных МП в воздухе рабочей зоны формализованы в инструкции по применению и позволяют проводить разработку МВИ для новых биопрепаратов в целях их оценки как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологических производств.
Список литературы Экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства
- Дудчик Н.В., Шевляков В.В. Моделирование биологического действия факторов среды обитания с целью их гигиенической оценки на основе прокариотических тест-моделей//Биологический фактор и микробиологическая диагностика при формировании здорового образа жизни: материалы 12-й Евразийской науч. конференции «Донозология-2016», 15-16 декабря 2016 г./под общей ред. М.П. Захарченко. -СПб., 2016. -С. 130-133.
- Изучение безопасности биотехнологических штаммов микроорганизмов с целью их гигиенического нормирования/Е.В. Буданова, Н.И. Шеина, Э.Г. Скрябина, Н.Г. Иванов, А.А. Воробьев, В.В. Зверев//Вестник Российской академии медицинских наук. -2010. -№ 11. -С. 42-46.
- К вопросу о гигиеническом нормативе содержания в воздухе рабочей зоны микробного препарата «Стимул»/В.В. Шевляков, В.А. Филонюк, Т.С. Студеничник, Г.И. Эрм, Н В. Дудчик//Медицинский журнал. -2013. -№ 4. -С. 135-139.
- Коломиец Э.И., Ракецкая О.А. Состояние и перспективы развития биотехнологии в Республике Беларусь//Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: сборник научных трудов. -Минск, 2013. -Т. 5. -С. 3-9.
- Методика выполнения измерений (МВИ) концентраций клеток штамма Pseudomonas aurantiaca В-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3 -продуцентов микробного препарата «Профибакттм-Фито»: МВИ.МН 5321-2015: свидетельство об аттестации № 896/2015 от 31.08.2015 г./разраб.: Н.В. Дудчик, В.В. Шевляков, В.А. Филонюк, О.Е. Нежвинская. -Минск: Белорусский государственный ин-т метрологии, 2015. -23 с.
- О методологии гигиенического регламентирования микроорганизмов-продуцентов и микробных препаратов в воздухе рабочей зоны/В.В. Шевляков, В.А. Филонюк, Г.И. Эрм, Е.В. Чернышова, С.А. Ушков, А.В. Буйницкая, Т.С. Студеничник//Медицинский журнал. -2014. -№ 2. -С. 40-53.
- Обоснование предельно допустимой концентрации (ПДК) в воздухе рабочей зоны микробного препарата «Бетапротектин»/В.В. Шевляков, В.А. Филонюк, Т.С. Студеничник, Г.И. Эрм, Н.В. Дудчик//Медицинский журнал. -2013. -№ 2. -С. 123-126.
- Обоснование предельно допустимых концентраций и методик выполнения измерений содержания в воздухе рабочей зоны микроорганизмов-продуцентов и микробных препаратов на их основе: инструкция по применению № 009-1015/В.В. Шевляков, В.А. Филонюк, Н.В. Дудчик, Г.И. Эрм, Т.С. Студеничник, Т.О. Козлова, Е.В. Чернышова, Ю.А. Соболь, А.В. Буйницкая, О.Е. Нежвинская, С.А. Янецкая, Л.М. Сычик. -Минск: Научно-практический центр гигиены, 2015. -30 с.
- Проблемы и перспективы гигиенического нормирования биотехнологических штаммов микроорганизмов/Ю.П. Пивоваров, Н.И. Шеина, Н.Г. Иванов, В.В. Королик, Э.Г. Скрябина//Гигиена и санитария. -2010. -№ 5. -С. 9-12.
- Разработка гигиенического норматива и метода контроля содержания в воздухе рабочей зоны комбинированного микробного препарата «ПрофибактТМ-Фито»/В.А. Филонюк, В.В. Шевляков, Н.В. Дудчик, Г.И. Эрм, А.А. Ушков//Медицинский журнал. -2015. -№ 4. -С. 128-136.
- Разработка и валидация методик выполнения измерений содержания однокомпонентных микробных препаратов на основе штаммов-продуцентов родов Bacillus и Pseudomonas в воздухе рабочей зоны/Н.В. Дудчик //Актуальные проблемы транспортной медицины. -2016. -№ 4. -С. 21-29.
- Сергеюк Н.П., Супрун И.П., Буянов В.В. Токсикология промышленных микроорганизмов. -М.: Институт проблем химической физики РАН, 2003. -127 с.
- Соседова Л.М., Рукавишников В.С., Шаяхметов С.Ф. Токсико-гигиенические аспекты оценки риска изолированного и сочетанного воздействия биотехнологических продуктов//Медицина труда и промышленная экология. -2003. -№ 3. -С. 15-19.
- Шеина Н.И. Критерии оценки биобезопасности микроорганизмов, используемых в биотехнологической промышленности//Вестник Оренбургского государственного университета. -2012. -№ 6. -С. 165-169.
- Baker M. Ten years of Nature Biotechnology research//Nat. Biotechnology. -2006. -Vol. 24, № 301. - DOI: 10.1038/nbt0306-301a
- Barreto de Castro L.A. Graduate programs in Brazil need reevaluation to contribute for innovation in biotechnology //Biotech. Research and Innovation. -URL: https://doi.org/10.1016/j.biori.2017.01.001 (дата обращения: 29.05.2017).
- Kumar R., Singh O.V. Biotechnological production of gluconic acid: future and implication//Appl. Microbiol. and Biotechnol. -2007. -Vol. 75, № 4. -P. 713-722.
- Recent developments and innovations in solid state fermentation /C.R. Soccol //Biotech. Research and Innovation. -URL: https://doi.org/10.1016/j.biori.2017.01.002 (дата обращения: 29.05.2017).
- The yeast Kluyveromyces marxianus and its biotechnological potential/G.G. Fonseca //Appl. Microbiology a. Вiotechnology. -2008. -Vol. 79, № 3. -P. 339-354.
