Экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства

(МП) возможно загрязнение ими производственной среды, выделение в воздух рабочей зоны и атмосферы веществ с вредным воздействием на здоровье работников и населения [2, 3, 6, 9, 12, 13, 14]. В промышленных условиях наличие МО в воздухе рабочей зоны, непосредственный контакт с микробными аэрозолями в процессе использования могут являться факторами риска здоровью работников биотехнологических производств, поскольку промышленные штаммы МО малопатогенны, но обладают сильной или выраженной сенсибилизирующей способностью (1–2-й класс аллергенной опасности) [13, 14].

Поэтому актуальным и практически значимым является изучение свойств микроорганизмов и оценка опасности и вероятности неблагоприятных для здоровья человека последствий производства биотехнологической продукции, содержащей жизнеспособные клетки и их структурные элементы, эффективная медицинская профилактика их вредного действия, гигиеническое нормирование и контроль за их содержанием в объектах среды обитания человека. Научное обоснование и практика гигиенического и экологического нормирования биологических факторов среды обитания имеют ряд принципиальных особенностей и в методическом плане разработаны меньше, чем химических факторов. В Республиканском унитарном предприятии «Научно-практический центр гигиены» Министерства здравоохранения Республики Беларусь разработка методологии и методов гигиенического регламентирования и нормирования МО и МП как биологических факторов среды обитания человека является одним из ведущих научных направлений, сформирована научная школа в данном, как мы считаем, перспективном, направлении профилактической медицины. В результате выполненных комплексных токсиколого-гигиенических исследований проведено гигиеническое регламентирование более 100 МО и МП, установлены предельно допустимые концентрации (ПДК) в воздухе рабочей зоны 12 новых одно- и многокомпонентных МП [1, 3, 5–8, 10, 11].

Эффективный производственный контроль ПДК нормированных МО и МП в воздухе рабочей зоны основан на использовании валидированных инструментальных методов количественной оценки.

Разработка стандартизованных и валидированных методик выполнения измерений (МВИ) концентраций МП и МО в воздухе рабочей зоны представляет собой достаточно сложную анали- тическую задачу, так как экспериментальное моделирование микробных аэрозолей включает оптимизацию всех параметров инструментального метода (условий отбора проб воздуха при различной микробной нагрузке, культивирования и идентификации МО и др.), определение аналитических характеристик, связанных со специфичностью и селективностью, концентрационных зависимостей и пределов чувствительности разрабатываемого метода. Методические приемы и алгоритмы расчета операционных характеристик разработаны для таких матриц, как водные среды, пищевые продукты, и отсутствуют для оценки метрологических параметров измерений биологического фактора воздушной среды [6, 7].

Целью работы являлось экспериментальное моделирование аэрозолей микроорганизмов-продуцентов многокомпонентного микробного препарата в воздухе рабочей зоны как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологического производства, а также разработка методики выполнения измерений в воздухе рабочей зоны концентрации Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3.

Материалы и методы. Объектом исследования являлся новый МП «Профибакт^тм-Фито» на основе клеток Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17, клеток и спор штамма Bacillus sp. BB58-3, разработанный государственным научным учреждением «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси».

В работе использовали систему для создания жидких аэрозолей в затравочных камерах объемом 250 л («Спектролаб», РФ); аспиратор SAS SUPER100 (PBI International, Италия), а также стандартное оборудование микробиологических лабораторий. Средства измерений и основное оборудование были должным образом проверены и калиброваны.

В работе использовали селективную среду следующего состава: триптон – 10,0 г; дрожжевой экстракт – 1,0 г; кальций хлористый безводный – 0,02 г; агар микробиологический – 15 г. Для приготовления рабочих разведений МП использовали фосфатный буферный раствор с 0,1%-ным пептоном, рН 7,0. Подтверждение содержания микробных клеток в рабочей культуре проводили путем высева на селективную агаризованную среду приведенного состава. Для оптимизации параметров отбора проб и определения рабочих характеристик детектора (контактные чашки Петри с соответствующей пита- тельной средой) использовали рабочее разведение 106 КОЕ/мл препарата.

На последующих этапах экспериментального моделирования микробного аэрозоля в затравочной камере проводили отбор проб воздуха в диапазоне объемов 10–50 л. Пробы воздуха отбирали аспирационным методом на поверхность агаризованной селективной среды указанного состава в двух повторностях, инкубировали в течение (48 ± 2) ч при (30 ± 0,5) °С и производили подсчет выросших типичных колоний МО. Оценивали культурально-морфологические особенности сформированных колоний и подсчитывали число типичных колоний.

Расчет концентрации МО, КОЕ/м3, производили по формуле:

Х = ( N · 1000) / V , (1)

где Х – концентрация микробных клеток и спор в воздухе рабочей зоны; N – количество колоний МО на чашке; 1000 – коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха; V – объем отобранной пробы воздуха, дм³.

Результаты и их обсуждение. МО родов Bacillus и Pseudomonas применяются для биологического стимулирования роста и развития сельскохозяйственных культур, а также в качестве средства биологической защиты (табл. 1).

Гигиенические нормативы содержания в воздухе рабочей зоны (ПДК) установлены для МП на уровне 5000 КОЕ (микробных клеток) /м³ по Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp . BB58-3, IV класс опасности [8].

Разработанная технология количественного определения МО в воздухе рабочей зоны в модельном эксперименте основана на классических этапах и приемах микробиологической практики: отбор проб воздуха аспирационным способом с учетом отобранного объема, культивирование в оптимальных для изучаемых МО условиях на питательной среде приведенного состава, подсчет сформированных колоний с характерными морфологическими признаками, морфологическая идентификация микроорганизмов и колоний, расчет количества микроорганизмов на чашках с перерасчетом на 1 м3 воздуха.

На созданной модели распыления в затравочных камерах объемом 250 л установки ингаляционного моделирования жидких аэрозолей отработаны режимы создания диапазона концентраций МО в замкнутом объеме с использованием различных типов распылителей, при разных скоростях подачи на эжекторы и на распылители потока воздуха, экспозициях распыления МП. Оптимизированы параметры аспирационного способа отбора проб воздуха (время и объем) при разных уровнях микробной нагрузки, проведена оптимизация состава сред и режимов культивирования МО с их последующей идентификацией. Полученный массив экспериментальных данных позволил выявить характер и закономерности роста МО в зависимости от концентрации МП в фиксированном объеме затравочной камеры. Характер зависимости между количеством колоний на чашке и отобранным объемом воздуха носил линейный характер и описывался приведенным на рисунке уравнением. Коэффициенты детерминации R² находились в диапазоне 0,93–0,96, что свидетельствует о высокой достоверности полученных результатов количественного определения концентраций МО в воздухе рабочей зоны (рисунок).

Таблица 1

Характеристика МП «ПрофибактТМ-Фито»

Источник получения штаммов-продуцентов	Морфологические, культуральные и биохимические признаки штаммов
Bacillus sp. BB58-3 получен в результате индуцированного мутагенеза природного штамма, антагонист фитопатогенных грибов, не фитотоксичен, стимулирует рост растений	Неподвижные грамположительные спорообразующие прямые палочки с округлыми концами, размером 0,6 х 3-4 мкм. Колонии мелкие (1,0-3,0 мм) округлые, плосковыпуклые с ровными лопастными краями, кремового цвета, непрозрачные, с неоднородной внутренней структурой. Каталазоположителен, термоустойчив, облигатный аэроб, обладает протеолитической и амилолитической активностью
Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 – получен путем многоступенчатого мутагенеза природного штамма	Подвижные, грамотрицательные, прямые палочки с округлыми концами, размером 0,6 х 2-3 мкм, с 2-4 монополярными жгутиками. Гладкие, плоские, круглые с ровными краями колонии размером 2–3 мм, желтовато-оранжевого цвета, с однородной внутренней структурой, облигатный аэроб, синтезируют антибиотики феназинового ряда. В качестве азота утилизирует соли аммония, мочевину и нитраты

Рис. Динамика роста штаммов-продуцентов Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp. BB58-3 в модельном эксперименте

Операционные характеристики для проведения метрологической аттестации МВИ были оценены в соответствии с требованиями Меж- дународной организации по стандартизации (ИСО): определение показателей прецизионности (повторяемость и промежуточная прецизионность с изменяющимся фактором «оператор»), расширенной неопределенности и иных операционных характеристик, а также присущих для оценки биологических факторов показателей специфичности, чувствительности, частоты ложноположительных и ложноотрицательных результатов и др. [8, 11]. На основе массива данных, полученных в модельном эксперименте, были оценены операционные характеристики методов, проведена метрологическая аттестация и утверждены МВИ концентрации МО в воздухе рабочей зоны [5]. В табл. 2 представлены метрологические характеристики и показатели специфичности и селективности разработанных методик.

Таблица 2

Метрологические характеристики и показатели специфичности и селективности методики

Метрологические характеристики. Показатели специфичности и селективности	Тип оценки	Значение
		Pseudomonas aurantiaca B-162/255.1	Bacillus sp. BB58-3
Взвешенное совокупное относительное стандартное отклонение подсчета ( S z )	A	0,052
Стандартное отклонение повторяемости ( S r )	A	0,012 log 10 КОЕ/м3
Предел повторяемости ( r )	А	0,034 log 10 КОЕ/м3
Стандартное отклонение промежуточной прецизионности (внутрилабораторной воспроизводимости) ( S l ( O ) )	A	0,147 log 10 КОЕ/м3
Предел промежуточной прецизионности ( r l ( O ) )	А	0,41 log 10 КОЕ/м3
Расширенная неопределенность ( k = 2) ( U )	A	0,30 log 10 КОЕ/м3
Чувствительность	A	1,0	0,96
Специфичность	A	0,8	0,6
Частота ложноположительных результатов	A	0,038	0,074
Частота ложноотрицательных результатов	A	0	0,25
Селективность	A	1,415	1,431
Эффективность	A	0,97	0,93
Верхний предел линейности	A	Не более 150 типичных колоний на чашку при общем числе колоний не более 300	Не более 150 типичных колоний на чашку при общем числе колоний не более 300

Выводы. В результате выполненного экспериментального моделирования аэрозолей многокомпонентного МП в воздушной среде получены зависимости содержания МО на последовательных этапах эксперимента и разработан количественный метод их оценки. Оценены операционные характеристики метода определения штаммов Pseudomonas aurantiaca B-162/255.17 и Bacillus sp. BB58-3 в воздушной среде, разработана аттестованная Белорусским государственным институтом метрологии МВИ концентраций МП в воздухе рабочей зоны. Использование МВИ в рам- ках области аккредитации микробиологических лабораторий обеспечивает объективный санитарно-производственный контроль содержания данных МП в производственной среде на соответствие их ПДК. Научно обоснованные унифицированные подходы разработки МВИ концентраций многокомпонентных МП в воздухе рабочей зоны формализованы в инструкции по применению и позволяют проводить разработку МВИ для новых биопрепаратов в целях их оценки как фактора риска воздействия на здоровье работников биотехнологических производств.