Экспресс-оценка содержания масла и влаги в семенах масличного льна с помощью ИК-спектрометрии

Введение. Масличный лён как культура входит в четверку основных масличных культур Российской Федерации. Посевные площади его в 2019 г., по данным Росстата, в хозяйствах всех категорий находились на уровне 815 тыс. га.

Лен масличный – перспективная, высокорентабельная сельскохозяйственная культура, не требующая больших затрат на ее возделывание. Семена льна широко используются в пищевых, технических и медицинских целях. Из семян льна получают масло, а шрот как ценная добавка идет на корм скоту [1; 2].

Масло льна представляет собой не только продукт питания, но и растительное сырье для многих отраслей промышленности: косметической, фармацевтической, лакокрасочной и олеохимии. С каждым годом растет сфера непищевого применения масла [3; 4; 5].

Если рассматривать масло как пищевой продукт, то оно должно иметь высокую биологическую ценность, обусловленную, как минимум, содержанием эссенциальных (незаменимых) жирных кислот, и хорошую стойкость при хранении [6; 7].

Масло льна обладает высокой биологической ценностью, определенной составом эссенциальных полиненасы-щенных жирных кислот (ПНЖК): линолевой (ω6) и ά-линоленовой (ω3). В составе масла их (ПНЖК) содержание может составлять более 80 %. В организме человека они не синтезируются, поэтому должны поступать в него с пищей. Линолевая и линоленовая кислоты обладают F-витаминной активностью, причем линолевая в 10 раз сильнее линоленовой кислоты по величине воздействия на организм. По рекомендациям института питания РАМН для молодого здорового организма достаточно для полноценного 64

усваивания, чтобы баланс ПНЖК был 10 : 1, для лечебного питания соотношение между ω6 и ω3 кислотами должен быть от 3 : 1 до 5 : 1 [8; 9].

Стойкость масла льна при хранении, в жирно-кислотном составе которого содержатся в большом количестве ПНЖК, особенно линоленовая (ω3), резко падает из-за её окисления кислородом воздуха. При этом образуются канцерогенные продукты окисления. Поэтому необходимо идти по пути поиска щадящих технологий получения масла, а также селекционным путем добиваться уменьшения содержания линоленовой кислоты.

Селекционерами ВНИИМК созданы сорта льна с большим разнообразием по содержанию полиненасыщенных жирных кислот. Так, например, содержание линоленовой кислоты изменяется от 3,5 до 66,2 %, а баланс ПНЖК весьма разнообразен и соотношение между ω6 и ω3 кислотами может быть от 1 : 6,5 и до 20 : 1. Поэтому необходимо вести работу по созданию сортов масличного льна с оптимальным жирно-кислотным составом и высоким содержанием масла в семенах для различных областей применения.

Во ВНИИМК оценка по масличности селекционного материала льна проводилась в отделе физических методов исследований с помощью ЯМР-анализатора АМВ 1006М.

С другой стороны, для удешевления исследований и увеличения производительности труда при оценке одновременно различных биохимических показателей в семенах без их разрушения возможно с помощью ИК-спектрометрии. Градуировочные модели были разработаны по нескольким показателям на семенах сои, рапса и горчицы [10; 11; 12].

На первом этапе исследований была поставлена задача разработать градуировочные модели на ИК-анализаторе Matrix-I фирмы Bruker Optics (Германия) по определению масличности и влажности в целых семенах масличного льна.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории биохимии на коричневых и желтосемянных образцах масличного льна, выращенных в 2015– 2020 гг. на центральной экспериментальной базе и в филиалах ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК.

Сформированные калибровочную и проверочную партии образцов семян по 18–20 г в алюминиевых бюксах выдерживали в комнатных условиях несколько дней для стабилизации семян по влажности и температуре.

Масличность определяли на ЯМР-анализаторе АМВ 1006М стандартизированным методом [13]. Влажность семян оценивали весовым методом высушивания при 130 оС в течение 40 мин [14].

Снятие и регистрацию спектров проводили в соответствии с руководством на программное обеспечение (ПО) OPUS ИК-спектрометра MATRIX-I с пересыпанием в кювете диаметром 51 мм каждого образца в трех повторностях.

Оценку правильности полученных градуировочных моделей выполняли на проверочной партии образцов по величине средней погрешности согласно нормативным документам по ИК-спек-трометрии [15]. Для повышения производительности труда и сохранения ценного селекционного материала исследования проводили только на целых семенах льна масличного.

Результаты и обсуждение. Массовая доля влаги в семенах значительно влияет на качество разрабатываемых градуировочных моделей и на получение предсказанных значений биохимических показателей. Для этого необходимо было построить градуировочную модель зависимости влажности семян от спектров их отражения в ближней инфракрасной области. С целью решения этой задачи была сформирована партия семян льна, состоящая из 12 образцов и четырех сортов (Ручеек; ВНИИМК 620; Бирюза; ФЛИЗ) селекции ВНИИМК. Путем определенных манипуляций, включающих в себя сушку семян при температуре не выше 40 ºС и увлажнение их в эксикаторе определенное время, была получена калибро- вочная партия семян в количестве 82 образцов. Диапазон изменчивости по влажности составил от 4,41 до 12,2 %.

Градуировочные спектры регистрировались на приборе Matrix-I с пересыпанием в трех повторностях в стаканчике диаметром 51 мм (навеска 10 г) в режиме отражения. После чего в этих образцах незамедлительно определялась влажность стандартным методом.

Широкий диапазон влажности семян льна, а также качественно проведенный анализ на содержание влаги подготовленной партии семян позволил создать устойчивую градуировочную модель для определения влажности в целых семенах (рис. 1).

Рисунок 1 – График предсказанных значений содержания влаги (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания влаги (Ось Х) градуировочной модели Flax_51_Wet

Как видно из графика, предсказанные значения трех повторностей имеют малую дисперсию, располагаясь практически на прямой. Очень высокий коэффициент детерминации (99,93) имела полученная модель при 10 рангах в многофакторном анализе.

Сравнительный анализ семян льна проверочной партии на определение влажности (табл. 1) выявил, что разница между спектральными показаниями и стандартным методом единичных значений была от -0,12 до 0,17 % и в среднем составила 0,09 %. Предельно допустимое значение погрешности в параллельных измерениях  стандартным методом не должно превышать 0,25 %.

Таблица 1

Сравнительный анализ семян льна по определению влажности стандартным и спектральным методами г. Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2017 г.

№ образца	Влажность, %
	метод
	стандартный	спектральный	Δ
1	6,17	6,25	-0,08
2	6,20	6,23	-0,03
3	6,44	6,49	-0,05
4	7,07	7,08	-0,01
5	7,61	7,53	0,08
6	8,03	8,15	-0,12
7	8,56	8,46	0,10
8	8,77	8,60	0,17
9	9,57	9,50	0,07
10	9,93	9,86	0,07
11	10,12	10,06	0,06
12	10,32	10,18	0,16
13	10,63	10,75	-0,12
Диапазон	6,17–10,63	6,23–10,75	-0,12–0,17
Среднее	8,42	8,39	0,09

Таким образом, получена градуировочная модель Flax_51_Wet по определению влаги в семенах льна. По качеству оценки исследования влаги метод ИК-спектрометрии может использоваться в качестве индикаторного показателя поступающих образцов на анализ. Если влажность семян превышает интервал 5– 7 %, то поступающие семена подвергаются стабилизации по этому показателю. В противном случае, погрешность определения биохимических показателей значительно увеличивается.

Исследовательская работа по созданию градуировочной модели по определению масличности семян масличного льна была проведена на семенах урожая 2015, 2016 и 2017 гг. Подобрали партию семян в количестве 105 образцов с максимально возможным диапазоном изменчивости по этому признаку. Различия по маслично-сти между образцами составили около 10 % (от 40,8 до 50,7 %). В качестве эталонного метода оценки масличности семян был выбран гостированный метод определения масличности с помощью импульсного ядерного магнитного резо-66

нанса (ЯМР) на образцовой установке прибора АМВ-1006М [13]. Масса навески составляла около 18 г.

Было получено 315 калибровочных спектров, на основе которых с помощью первой производной в сочетании с мультипликативной коррекцией рассеивания построена градуировочная модель по определению масличности семян льна (рис. 2).

Ранг: 11   R"2 = 99.33   RM SE Р = 0.224 Bias: 0.025 RPD: 123

Рисунок 2 – График предсказанных значений содержания масла в семенах льна (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания масла в семенах льна (Ось X) градуировочной модели Flax_51_Oil

Данная модель (рис. 2) характеризовалась относительно высоким коэффициентом детерминации (99,33) при 11 рангах. Среднеквадратичная погрешность предсказания (RMSEP) разработанной модели составила 0,22 %, что соответствует как 1 сигма в дисперсионном анализе с вероятность 65 %. При вероятности 95 %, что соответствует 2 сигмам – 0,45 % ошибка единичного измерения. Показатель RPD ( R esidual P rediction D eviation – значение остаточного отклонения предсказания для ранга, отображаемого на рисунке 1) разработанной градуировочной модели оценивает устойчивость полученной зависимости. По оценке разработчиков программного обеспечения OPUS принято, что величина этого значения в пределах от 6,0 до 7,9 квалифицируется как «очень хорошая зависимость», а при значении более 10,0 рассматривается как

«превосходная». Искомая модель характеризуется величиной RPD 12,3 единиц.

Для подтверждения правильной работы градуировочной модели по определению    содержания    масла    была проанализирована проверочная партия семян в том же диапазоне изменчивости, что и при разработке модели (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительный анализ масличности семян льна разными физическими методами г. Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2017 г.

№ образца	Масличность, %		Разница, %
	метод
	ЯМР	спектральный	абсолютная	относительная
1	41,2	41,3	- 0,1	0,24
2	42,2	42,1	0,1	0,24
3	42,4	42,5	- 0,1	0,23
4	43,3	43,4	0,1	0,23
5	44,6	44,2	0,6	1,34
6	45,1	44,5	0,3	0,66
7	45,6	45,2	0,3	0,65
8	46,3	46,2	0,4	0,86
9	47,3	47,0	- 0,1	0,21
10	48,2	48,4	- 0,4	0,83
11	49,5	49,1	0,4	0,81
Диапазон	41,2–49,5	41,3–49,1	-0,4–0,6	0,21–1,34
Среднее	45,1	44,9	0,26	0,57

Незначительно отличаются средние значения масличности семян проверочной партии, полученные разными методами. В среднем ошибка определения содержания массовой доли масла в семенах составила на выборке из 11 образцов 0,26 % в абсолютных единицах, относительная ошибка при средних значениях показателя не превысила 1,5 % и в среднем была равна 0,57 %.

Таким образом, разработанная градуировочная модель Flax_51_Oil по определению масличности в целых семенах масличного льна соответствует нашим требованиям по точности анализа семян.

Для апробации нашей разработки в 2018 г. была проведена массовая оценка селекционного материала масличного льна по определению массовой доли масла и влаги. Влажность семян соответствовала заявленным требованиям при оценке образцов на ИК-спектрометре. По мас- личности семян были выделены образцы со значением признака ниже, чем в градуировочной модели.

Анализ сформированной проверочной партии выявил повышение погрешности определения как единичных измерений, так и среднего значения партии до 0,43 %. То есть погрешность оценки возросла в 2 раза (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ масличности семян льна разными физическими методами г. Краснодар, ЦЭБ ФНЦ ВНИИМК, 2018 г.

№ образца	Масличность, %		Разница, %
	метод
	ЯМР	спектральный	абсолютная	относительная
1	39,76	39,10	0,66	1,66
2	39,94	39,35	0,59	1,48
3	40,33	40,56	- 0,23	0,57
4	40,48	40,93	- 0,45	1,11
5	40,92	40,49	0,43	1,05
6	41,84	42,18	- 0,34	0,81
7	42,10	41,75	0,35	0,83
8	42,32	42,03	0,29	0,69
9	42,81	42,05	0,76	1,78
10	43,28	43,07	0,21	0,49
11	45,14	44,98	0,16	0,35
12	47,46	46,72	0,74	1,56
Диапазон	39,76–47,46	39,1–46,72	-0,45–0,76	0,35–1,78
Среднее	45,1	44,9	0,43	1,03

По результатам проверочной партии было принято решение накопить образцы для заполнения пробелов в градуировочной модели и поиску уникальных образцов для расширения диапазона изменчивости, а также обратить внимание на цвет семян льна, который бывает не только коричневым и желтым. Встречаются темно-коричневые, светло-коричневые, темно-желтые, а также и примеси желтых в коричневосемянных. ИК-спектрометрия основана на отражении в ближней инфракрасной области, и цвет семян оказывает значительное влияние на результирующие спектры. Что и было выявлено по анализу проверочной партии образов урожая 2019 г.

По результатам массовой оценки селекционного материала масличного льна была подобрана очередная проверочная партия образцов (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительный анализ масличности семян льна разными физическими методами г. Краснодар, ЦЭБ ФНЦ ВНИИМК, 2019 г.

№ образца	Масличность, %		Разница, %
	метод
	ЯМР	спектральный	абсолютная	относи тельная
1	38,70	38,42	0,28	0,72
2	39,52	39,12	0,40	1,01
3	41,39	40,67	0,72	1,74
4	42,95	42,55	0,40	0,93
5	43,08	42,60	0,48	1,11
6	44,88	44,80	0,08	0,18
7	44,89	44,48	0,41	0,91
8	46,40	45,77	0,63	1,36
9	46,47	46,09	0,38	0,82
10	48,03	47,45	0,48	1,00
11	48,21	47,90	0,31	0,64
12	48,44	48,16	0,28	0,58
Диапазон	38,70–48,44	38,42–48,16	0,08–0,72	0,18–1,74
Среднее	44,4	44,0	0,40	0,92

Среднее значение погрешности проверочной партии составило 0,4 %, что допустимо согласно ГОСТ 32749-2014 на определение влаги и жира методом спектроскопии в ближней инфракрасной области. Однако наблюдается смещение в сторону занижения результатов измерения масличности семян.

Были учтены все выявленные замечания, подобрана градуировочная партия и проведена разработка новой градуировочной модели (рис. 3).

Рисунок 3 – График предсказанных значений содержания масла в семенах льна (Ось Y) по сравнению с истинными значениями содержания масла в семенах льна (Ось X) градуировочной модели

Flax_51_Oil_20

Диапазон изменчивости удалось увеличить до 12 %, от 37,97 до 50,70 % мас-личности семян льна. Количество образцов калибровочной партии составило 146 шт., из них 61 образец желтосемян-ного льна, что соответствует 41,8 %.

Полученная градуировочная модель при 10 рангах имеет высокий коэффициент детерминации 99,2 и хорошую устойчивость при RPD 11,2. RMSEP разработанной модели, то есть среднеквадратичная погрешность предсказания, составила 0,27 %, что несколько выше, чем предыдущая. Только прямые испытания на проверочной      партии      показывают приемлемость использования разработанной модели (табл. 5).

Таблица 5

Сравнительный анализ масличности семян льна разными физическими методами г. Краснодар, ЦЭБ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.

№ образца	Масличность, %		Разница, %
	метод
	ЯМР	спектральный	абсолютная	относительная
1	39,25	38,96	0,29	0,74
2	39,58	39,57	0,01	0,03
3	40,31	40,32	- 0,01	0,02
4	41,15	41,22	- 0,07	0,17
5 ж	42,82	42,75	0,07	0,16
6 ж	42,97	42,49	0,48	1,12
7	43,30	43,03	0,27	0,62
8 ж	43,45	42,88	0,57	1,31
9 ж	43,61	43,07	0,54	1,24
10	44,40	44,71	- 0,31	0,70
11	45,49	45,52	- 0,03	0,07
12	46,28	46,17	0,11	0,24
13	46,48	46,40	0,08	0,17
14	47,05	47,29	0,24	0,51
15 ж	47,15	47,35	- 0,20	0,42
16 ж	47,66	47,50	0,16	0,34
17	47,71	47,13	0,58	1,22
18	47,98	47,69	0,29	0,60
19 ж	48,25	48,18	0,07	0,15
20 ж	48,72	48,77	- 0,05	0,10
Диапазон	39,25–48,72	38,96–48,77	- 0,31–0,58	0,02–1,31
Среднее	44,68	44,55	0,22	0,50

Примечание: ж – желтосемянные образцы масличного льна

Полученные нами данные (табл. 5) не позволили выявить влияния цвета семян на величину погрешности определения масличности. Абсолютная разница жел-тосемянных из восьми образов получи- лась от -0,20 до 0,57 %, а коричневых – от -0,31 до 0,58 %. Средние значения выборки проверочной партии отличаются незначительно (0,13 %), а средняя абсолютная разница из 20 образцов составила 0,22 %.

Важно отметить, что калибровочная партия состояла из образцов семян льна урожая 2015–2019 гг. Проверочная партия была сформирована по результатам массовой оценки селекционного материала урожая 2020 г. Эти данные позволяют сделать два вывода: разработанная градуировочная модель Flax_51_Oil_20 для экспресс-оценки масличности семян льна полностью удовлетворяет предъявляемым требованиям по величине погрешности определения не более 0,7 %, селекционный материал масличного льна был оценен быстро и качественно.

После получения удовлетворительных значений погрешности определения мас-личности и влажности был разработан метод «Лен 51» в программе OPUS LAB для рутинного анализа по одновременному определению содержания маслично-сти и влажности. Характеристика входящих в метод моделей представлена в таблице 6.

Талица 6

Характеристика градуировочных моделей по определению олеиновой, линолевой, линоленовой кислот в масле и маслично-сти семян льна для ИК-спектрометрии г. Краснодар, ЦЭБ ФНЦ ВНИИМК, 2020 г.

Компонент	Ранг	R2	RMSEP	RPD	Предобработка	Коли чество калибровочных спектров, шт.
Масло	10	99,2	0,27	11,2	Первая производная + векторная нормализация	438
Влага	10	99,9	0,06	39,0	Первая производная + векторная нормализация	243

* Примечание : качество хемометрических моделей зависит от выбора правильного числа необходимых факторов, что также называется рангом модели; R² – коэффициент детерминации; RMSEP – среднеквадратичная погрешность предсказания; RPD – значение остаточного отклонения предсказания для ранга, отображаемого на графике

Выводы: Таким образом, разработана градуировочная модель «Лен 51» для определения содержания массовой доли масла и влаги в семенах масличного льна в средней пробе (9–20 г) в кювете диаметром 51 мм. Это дает возможность оперативно проводить предварительную оценку селекционного материала с высокой скоростью – более 120 образцов за 7 ч работы без разрушения семян.