Экспресс-определение антиоксидантной активности кондитерских изделий с использованием одноразовой потенциометрической сенсорной системы

A.V. Tarasov, , N.V. Zavorokhina^, , Ural State University of Economics, Ekaterinburg, Russia

Использование БАВ с высоким антиоксидантным эффектом при моделировании ингредиентного состава пищевого продукта является наиболее простой возможностью повысить его функциональность для достижения кардио- и гепатопротекторных свойств, снижения оксидативного стресса организма человека при техногенных и иных нагрузках, повышения иммунитета, увеличения срока хранения и антиокислительных свойств пи- щевого продукта. При этом введение антиоксидантов должно быть контролируемым с возможностью их количественного определения. Сегодня существует множество методов количественного определения антиоксидантной активности – химические, физикохимические методы, в том числе спектроскопические, электрохимические методы, амперометрические, кулонометрические, вольтамперометрические и потенциометрические. Потенциометрический метод позволяет ре- шить ряд проблем, связанных с определением АОА - он наиболее простой и информативный из всех вышеперечисленных, не требует построения градуировочной шкалы и градуировки приборов. Особую трудность представляет определение АОА в полутвердых и твердофазных пищевых системах.

Потенциометрический метод с использованием медиаторной системы гексацианоферратов калия (K₃[Fe(CN)₆]/K 4 [Fe(CN)₆]) был предложен для анализа жидких и твердофазных образцов медиаторной системы гексацианоферратов калия в 2002 и 2010 годах. Исследования последующих лет свидетельствуют об успешном применении метода в пищевых [1–5], косметических [6], фармацевтических [7], и медицинских [8, 9] приложениях. Однако многоразовое использование в анализе коммерческих электродов требует их обслуживания, что затрудняет дальнейшее внедрение метода в промышленную и медицинскую практику. В частности, индикаторный платиновый электрод нуждается в предварительной очистке поверхности [10], а хлорсеребряный электрод сравнения требует периодического заполнения раствором внутреннего электролита и поверки потенциала. Таким образом, разработка не требующих обслуживания одноразовых электродов, предназначенных для потенциометрического определения АОА, является актуальной исследовательской задачей и направлена на сокращение разрыва между лабораторным и внелабораторным анализом.

В работах [11, 12] был описан планарный твердотельный электрод на основе хлорида и феррицианида серебра, обладающий стабильным потенциалом в среде с переменным содержанием K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], что позволило использовать его в качестве электрода сравнения в условиях потенциометрического определения АОА. Разработанный электрод сравнения в комбинации с планарным платиновым электродом служил потенциометрической сенсорной системой (ПСС), эффективность которой была подтверждена в анализе яблочных соков, биологических жидкостей [11], срезов фруктов и овощей [13]. Однако многоразовое применение индикаторного платинового электрода не позволило перевести формат измерений в полностью одноразовый. Кроме того, используемая в изготов- лении электродов алюмооксидная керамика приводила к удорожанию их себестоимости. В работе [12] была предложена полностью одноразовая ПСС на основе стеклотекстолита, в которой индикаторным электродом служил толстопленочный углеродсодержащий электрод, модифицированный наночастицами золота. Наночастицы золота были нанесены на поверхность углеродсодержащего электрода способом капельного литья и удерживались за счет физической адсорбции. Данный способ модификации поверхности является обратимым, поскольку образуемые при этом межмолекулярные взаимодействия носят нековалентный характер и могут быть разрушены в условиях эксплуатации или хранения электрода [14]. В этом исследовании была разработана новая одноразовая ПСС на основе модифицированных толстопленочных электродов, изготовленных с использованием поли-этилентерефталата (ПЭТ) в качестве подложки. Индикаторный электрод был модифицирован объемным способом, при котором на-норазмерный наполнитель был введен непосредственно в углеродную пасту. В качестве наноразмерного модификатора использовали многослойные углеродные нанотрубки (МУНТ), которые широко применяются в (био)сенсорах с целью улучшения их электрических, электронных, механических и аналитических характеристик [15, 16]. Разработанная ПСС была успешно апробирована в анализе пищевых продуктов с твердой и полутвердой консистенцией.

Цель исследования - разработка высокоточной одноразовой потенциометрической системы-теста для определения антиоксидантной активности в твердых и полутвердых пищевых системах на примере кондитерских изделий.

Объекты и методы исследования

Объекты исследования. Все кондитерские изделия были приобретены в торговой розничной сети города Екатеринбурга. Характеристика исследованных кондитерских изделий российского производства представлена в табл. 1. Поскольку используемые образцы при комнатной температуре имели твердую, полутвердую, и упругую желейную стабильные структуры, в тексте далее использовали термин «твердофазные объекты».

Таблица 1

Перечень исследованных кондитерских изделий

Наименование	Изготовитель	Состав
Конфеты, покрытые глянцевателем с желейным корпусом СМУЗИ «Eco-botanica» черника-банан	ОАО «Рот Фронт»	Пюре черничное, пюре банановое, краситель антоциан, витаминный премикс
Конфеты, покрытые глянцевателем с желейным корпусом СМУЗИ «Eco-botanica» ананас-манго	ОАО «Рот Фронт»	Пюре яблочное, концентрированный ананасовый сок, краситель куркумин, порошок манго, витаминный премикс
Зефир «Eco-botanica» с кусочками брусники, растительным экстрактом и витаминами	ОАО «Рот Фронт»	Пюре яблочное, клюква сушеная (кусочки), брусника сушеная (кусочки), сухой растительный экстракт клюквы, витаминный премикс
Конфеты в шоколаде со сбивным корпусом «Медофеты» суфле с лесной клубникой	ООО «Частные пасеки Берестова»	Антиокислитель токоферол (витамин Е), плодовый наполнитель клубника с земляникой, мед натуральный
Пастилки «Вишня и Смородина»	АО «КФ «Пермская»	Концентрированный яблочный сок, пюре яблочное концентрированное, пюре вишневое концентрированное, концентрированный сок черной смородины, волокна пищевые цитрусовые
Конфеты глазированные «Чернослив Кремлина шоколадный с грецким орехом»	ООО «КФ «Кремлина»	Слива сушеная (чернослив), пюре сливовое, ядро грецкого ореха
Конфеты глазированные «Курага Кремлина шоколадная с грецким орехом»	ООО «КФ «Кремлина»	Абрикос сушеный (курага), пюре абрикосовое, ядро грецкого ореха

Реактивы и материалы. Феррицианид калия K3[Fe(CN)6], ферроцианид калия K4[Fe(CN)6]·3H2O, хлорид калия KCl, хлорид натрия NaCl, гидрофосфат натрия Na2HPO4·12H2O и дигидрофосфат калия KH2PO4 квалификации «химически чистый» были поставлены АО «Химреактивснаб» (Россия). Полимерная пленка на основе ПЭТ толщиной 0,5 мм и 5 %-ный раствор Nafion 117 были получены от Fellowes Inc. (США) и Sigma-Aldrich Co. (США), соответственно. Серебряная краска Mechanic DJ912 и углеродные чернила Ceres были приобретены у Shenzhen Welsolo Electronic Technology Co., Ltd. (Китай) и Guangzhou Print Area Co. Ltd. (Китай), соответственно. МУНТ были поставлены ООО «МТС-нано» (Россия). Жидкий изолятор был получен при смешении клея Cementit Universal (Merz+Benteli AG, Швейцария) и ацетона в соотношении 1:5 по объему. Микропористый пленочный материал МФАС-ОС-2 на основе смеси ацетатов целлюлозы (ЗАО НТЦ «Владипор», Россия) ис- пользовали в качестве мембраны-носителя раствора с медиаторной системой.

Оборудование. Ручной станок трафаретной печати SPR-10 (DDM Novastar Inc., США) и сушильный шкаф ШС-0.25-60 (ООО НПП «Теплоприбор», Россия) использовали для изготовления и сушки толстопленочных электродов. Вольтамперометрический анализатор ИВА-5 в комплектации с хлорсеребряным электродом ЭВЛ–1M3.1 и стеклоуглеродным стержнем СУ-2000 использовали для реализации потенциостатического режима. Потенциостат-гальваностат PGSTAT 128N в комплектации с хлорсеребряным электродом 6.0726.100 и стеклоуглеродным стержнем 6.1248.040 (Metrohm AG, Швейцария) использовали для циклических вольтамперометрических измерений. pH-метр/иономер ТА-Ион в комплектации с коммерческими электродами или разработанной ПСС использовали для потенциометрических измерений. Коммерческими электродами служили платиновый электрод 6.1204.310 в корпусе из полиэфирэ- фиркетона с диаметром диска 3 мм (Metrohm AG, Швейцария) и хлорсеребряный электрод ЭВЛ–1M3.1.

Приготовление объектов исследования. Коллоидные растворы кондитерских изделий получали при растворении последних в горячей воде на водяной бане при 80 °С. Во всех случаях использовалось соотношение 2 г образца к 100 дм³ нагретой до 100 °С деионизованной воды (1:50). Предэкстракционные манипуляции включали удаление глазури кондитерских изделий. Постэкстракционные манипуляции включали охлаждение полученных образцов исследования на водяной бане, а также их последующее фильтрование через многослойную марлю коллоидных растворов кондитерских изделий, отличных от желейных.

Изготовление электродов ПСС. Индикаторный электрод ПСС представлял собой модифицированный толстопленочный углеродсодержащий электрод. Углеродные чернила с различным содержание МУНТ (0; 0,5; 1 и 2 % по массе) были нанесены на предварительно очищенную подложку ПЭТ методом трафаретной печати, а затем высушены в печи при 110 °С в течение 30 минут. Немодифициро-ванный и модифицированный толстопленочные углеродсодержащие электроды были обозначены С/ПЭТ и МУНТ/С/ПЭТ, соответственно. Электрод сравнения ПСС представлял собой модифицированный толстопленочный серебросодержащий электрод, изготовленный в соответствии с описанными ранее процедурами [11, 12]. На рабочей поверхности толстопленочного серебросодержащего электрода в потенциометрическом режиме был сформирован смешанный осадок, содержащий преимущественно хлорид серебра и феррицианид серебра. На заключительном этапе модифицированный осадком углеродсодержащий электрод был погружен в 1,25 %-ный раствор Нафиона для формирования защитного слоя, а затем этот электрод был отвержден в печи при 100 °С в течение часа. Единичные модифицированные серебросодержащие электроды имели размеры 40×2×0,5 мм и обозначались как Н/О/Ag/ПЭТ.

Применение ПСС в анализе пищевых образцов. Разработанная ПСС была применена в оценке АОА твердофазных пищевых образцов, примерами которых служили кондитерские изделия. Твердофазные образцы могут быть проанализированы в отсутствии и присутствии нагрузки. Срезы фруктов и овощей содержат большое количество жидкой фракции (сока), поэтому они могут быть проанализированы без внешнего давления с использованием медиаторной системы состава K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] = 0,1/0,001 моль/дм3 [13]. Кондитерские изделия содержат незначительное количество свободной воды, поэтому для измерения стабильного аналитического сигнала (потенциала) потребовалось применение внешнего давления. Электроды ПСС располагали горизонтально в плоскости стола. Поверх электродов укладывали мембрану, пропитанную натрий-фосфатным буфером pH 7,4, содержащим 0,001 моль/дм3 K3[Fe(CN)6] и 0,00005 моль/дм3 K4[Fe(CN)6]. Затем поверх мембраны располагали срез анализируемого кондитерского изделия толщиной (3 ± 1) мм, сделанный при помощи керамического ножа. Сверху устанавливали стальной груз массой 0,5 кг и диаметром основания 36 мм. В таких условиях давление, оказываемое грузом на ПСС и тестируемый образец, составило 4,82 кПа или 36,1 мм рт. ст. [6].

Обработка результатов анализа. АОА жидких образцов в моль-экв/дм³ рассчитывали по формуле:

АОА = Cox Cl ∙ CRed ∙d, , a=      ∙ 10∆ EF /2, 3RT ,

CRed

где C Оx – концентрация K 3 [Fe(CN) 6 ], моль/дм³;

C Red – концентрация K 4 [Fe(CN) 6 ], моль/дм³;

ΔE = (Е1 – E2) – изменение потенциала от на- чального до конечного значения, В; F = 96485,333 Кл/моль – постоянная Фарадея; R = 8,314 Дж/(моль·К) – универсальная газовая постоянная; T = Т(°С) + 273,15 – термодинамическая температура, К; d – разбавление пробы, безразмерная величина. АОА срезов пересчитывали на один грамм исходных твердофазных образцов по приведенной ниже формуле с учетом следующих допущений:

• 1)    коэффициенты диффузии антиоксидантов в образце и K 4 [Fe(CN) 6 ] в мембране близки и

• 2)    плотность образца и плотность пропитанной мембраны стремятся к единице.

Таким образом,

АОА (моль экв/дм )∙ 10 ³ z^X

АОА (моль - экв/г) =                     , (2)

где АОА(моль-экв/дм3) – значение, найденное по формуле (1); ρ – плотность образца, г/см3. Измерения АОА проводили в трехкратной повторности. Данные представлены в виде

X ± ΔX, где X – среднее арифметическое, ΔX – стандартное отклонение. Валидация результатов определения АОА пищевых систем, полученных с использованием ПСС, была проведена относительно результатов, полученных с использованием коммерческих электродов. Параметрами валидации служили критерий Фишера (F), критерий Стьюдента (t) и коэффициент корреляции Пирсона (r).

Результаты исследований и их обсуждение

Электрохимическая характеристика индикаторного электрода. В настоящей работе в составе разработанной ПСС применялся описанный ранее электрод сравнения Н/О/Ag/ПЭТ [11, 12], модификацией которого являлось использование неэлектропроводящей подложки (ПЭТ). В связи с этим научный интерес представляла характеристика нового индикаторного электрода, которая была выполнены методами циклической вольтамперометрии и потенциометрии. На рис. 1(а) представлены циклические вольтамперограм-мы, зарегистрированные с использованием индикаторного углеродсодержащего электрода в натрий-фосфатном буфере pH 7,4, содержащем эквимолярное количество ферри- и ферроцианида калия. Увеличение токов, наблюдаемое на циклических вольтамперо-граммах с ростом концентрации МУНТ, свидетельствует о возрастании электропроводности [15]. В то же время углеродсодержащий электрод, модифицированный 2 % масс. МУНТ, продемонстрировал снижение пластичности. Таким образом, в дальнейших исследованиях использовали углеродсодержащий электрод, модифицированный 1 % масс. МУНТ. Зависимость потенциала электрода МУНТ (1 % масс.)/С/ПЭТ в натрий-фосфатном буфере pH 7,4, содержащем различное соотношение K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], представлена на рис. 1(б). Угловой коэффициент полученной линейной зависимости равен 58,3 мВ, что близко к теоретическому значению коэффициента RT/nF в уравнении Нернста для одноэлектронного процесса, приблизительно равному 59 мВ при 25 °С .

Анализ кондитерских изделий. Применимость ПСС в оценке АОА твердофазных пищевых образцов была продемонстрирована на примере анализа срезов корпусов кондитерских изделий. Результаты оценки АОА срезов кондитерских изделий, полученные с использованием ПСС, были сопоставлены с результатами оценки АОА их коллоидных растворов, полученными с использованием коммерческих электродов. Срезы корпусов кондитерских изделий были проанализированы в отсутствии и присутствии местного давления 4,82 кПа. Результаты анализа срезов кондитерских изделий, полученные без нагрузки, характеризовались низкими значениями АОА, невоспроизводимостью и отсутствием корреляции с результатами анализа коллоидных

а)

Рис. 1. Циклические вольтамперограммы, зарегистрированные на толстопленочном углеродсо держащем электроде при скорости 50 мВ/с в натрий-фосфатном буфере pH 7,4, содержащем

1 ммоль/дм³ K 3 [Fe(CN) 6 ] и 1 ммоль/дм³ K 4 [Fe(CN) 6 ] (а). Зависимость потенциала МУНТ(1 % масс.)/С/ПЭТ в натрий-фосфатном буфере pH 7,4, содержащем различное соотношение K 3 [Fe(CN) 6 ]/K 4 [Fe(CN) 6 ] (б)

б)

растворов. Такие расхождения результатов объясняются, по-видимому, присутствием в составе кондитерских изделий влагоудерживающих агентов и, как следствие, незначительным содержанием свободной воды. Пенообразная консистенция, присущая пастильным кондитерским изделиям, также может оказывать влияние на измерительный процесс. Результаты оценки АОА срезов кондитерских изделий, полученные в условиях нагрузки, представлены в табл. 2. В этом случае была обнаружена значительная положительная корреляция с результатами анализа экстрактов: r = 0,92, p < 0,005.

лоидных растворов растворением при контролируемой температуре в качестве этапа подготовки твердофазных образцов, решают большой спектр аналитических задач, но характеризуются высокой трудоемкостью. Предложенный метод предполагает использование одноразовой потенциометрической сенсорной системы-теста, позволяющей использовать для определения АОА срез изделия под нагрузкой, при этом не требует длительной пробоподготовки. Предложенная ПСС является одноразовой, демонстрирует высокую аналитическую эффективность и может быть изготовлена массово в виде экспресс-тестов

Результаты анализа кондитерских изделий (n = 3)

Таблица 2

Наименование	АОА экстракта × 104, моль-экв/дм3*	АОА среза × 107, моль-экв/г**
Суфле «Медофеты» с лесной клубникой	1,15 ± 0,05	0,15 ± 0,07
Конфеты желейные «Eco-botanica» ананас-манго	2,11 ± 0,07	1,36 ± 0,15
Конфеты желейные «Eco-botanica» черника-банан	2,45 ± 0,07	1,81 ± 0,16
Зефир «Eco-botanica» с кусочками брусники	3,91 ± 0,15	0,31 ± 0,10
Пастилки «Вишня и Смородина»	9,98 ± 0,23	2,14 ± 0,26
Конфеты «Кремлина» с черносливом и грецким орехом	14,15 ± 0,33	6,15 ± 0,51
Конфеты «Кремлина» с курагой и грецким орехом	16,41 ± 0,37	8,69 ± 0,63

При использовании коммерческих электродов.

**

При использовании ПСС в условиях внешнего давления 4,82 кПа.

Заключение

Внесение антиоксидантов в пищевые системы с целью увеличения их функционального действия, повышения срока хранения создает потребность для их количественного определения. Существующие методы лабораторного определения АОА в кондитерских изделиях, использующие приготовление кол- для дальнейшего использования при определении АОА мармелада, зефира, пастильных и сбивных кондитерских изделий как в лабораторных, так и во внелабораторных исследованиях, в том числе в комплектации с потенциометрическим анализатором портативного типа предложенная ПСС может использоваться во внелабораторных условиях.