Экспрессия гена капсидного белка Х-вируса шалота в различных органах растений Allium cepa var. aggregatum

обнаружены. Структура остальной части генома ХВШ свидетельствует о том, что филогенетически аллексивирусы занимают близкую позицию к карла- и по-тексвирусам (3, 5).

Ген капсидного белка ХВШ (ОРС5) кодирует белок с молекулярной массой 28 кД (6). Однако в экстрактах листьев растений шалота, инфицированных ХВШ, а также в соответствующих очищенных вирусных препаратах присутствуют два типа серологически родственных капсидных белков с молекулярной массой 28 и 37 кД (1, 7). Механизмы синтеза и функциональная активность этих двух форм капсидного белка ХВШ неизвестны. Одним из экспериментальных подходов к решению этих проблем может служить исследование распределения той или иной формы капсидного белка ХВШ в клеточных структурах различных органов инфицированных растений, в частности в корнях. Имеются веские основания полагать, что вирусная инвазия корневой системы растения-хозяина представляет собой перспективную модель, позволяющую исследовать как молекулярные механизмы ингибирования вирусной инфекции по типу «умолчания генов», так и идентифицировать клеточные сигна-лы/факторы, индуцирующие защитные реакции и вирусспецифические супрессоры этого процесса (13).

В задачу нашего исследования входила локализация 28К- и 37К- форм капсидного белка ХВШ в различных компартментах клеток корней и листьев инфицированных растений шалота A. cepa var. aggregatum с целью выявления молекулярных механизмов образования вирионов ХВШ, различающихся по морфологическим признакам, а также оценки экспрессии и роли различных форм капсидного белка ХВШ в процессе вирусной инфекции.

Методика . Инфицированные ХВШ луковицы шалота высаживали в почву и выращивали в течение 1-3 нед. Для прямого серологического анализа экстрактов различных частей растений использовали свежие образцы листьев (ювенильные и зрелые) или корней. Очищенные вирусные препараты выделяли с помощью ранее описанного нами метода, предварительно разрушая ткани в ступке в присутствии жидкого азота (1). Разрушенные в жидком азоте ткани корней или листьев гомогенизировали в ступке (масса:объем — 1:5) с буфером следующего состава: 15 мМ MOPS (pH 7,4), 450 мМ сахароза, 1,5 мМ ЭДТА, 0,2 % бычий сывороточный альбумин, 10 мM дитиотреотол, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфлюорид и 0,6 % поливинилпирролидон (14). Этот гомогенат фильтровали через мираклот (Miracloth, Calbiochem), фильтрат центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин. Осадок, содержащий клеточные стенки, сохраняли, надосадочную жидкость декантировали и центрифугировали при 10000 g в течение 30 мин. Полученный осадок сохраняли, надосадочную жидкость центрифугировали при 30000 g в течение 30 мин. Осадок сохраняли, а фракцию микросом выделяли центрифугированием надосадочной жидкости при 100000 g в течение 30 мин. Все осадки, содержащие тот или иной исследуемый материал (клеточные стенки, митохондрии, пероксисомы или микросомы), суспендировали в воде. Серологический анализ вирусных белков в экстрактах различных частей растений, очищенных вирусных препаратах и исследуемых клеточных фракциях проводили методом иммуноблоттинга с использованием антисыворотки против рекомбинантного капсидного белка ХВШ, обладающей очевидным преимуществом перед антисыворотками, полученными посредством иммунизации животных вирусными препаратами. Детекцию белковых фракций осуществляли либо с помощью конъюгата антител с пероксидазой и соответствующего субстрата (TMB, Fermentas), либо прямым флюоресцентным методом с использованием антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с флюоресцентным красителем Cy3 (15). В последнем случае мембраны сканировали на лазерном сканере Typhoon 9200 ( λ = 532 нм, эмиссионный фильтр 580BP30, Amersham).

Результаты . При инициации вирусной инфекции в прорастающих луковицах шалота вирус может репродуцироваться как в ювенильных листьях, так и в корнях, которые на этой стадии онтогенеза развиваются наиболее интенсивно. На первом этапе работы мы провели серологический анализ нефракционированных экстрактов различных частей растений (рис. 1). В экстрактах корней инфицированных растений 28К-форма капсидного белка присутствовала постоянно и в высокой концентрации, тогда как 37К-форма обнаруживалась только на начальных стадиях инфекции (см. рис. 1, дорожки 1 и 2). При этом остается неизвестным, включается ли 37К-форма в состав вирусных частиц. В ряде экспериментов было показано, что в экстрактах листьев на поздних стадиях инфекции концентрация 37К-формы капсидного белка также может быть низкой (см. рис. 1, дорожка 4). Однако в выделенных из таких листьев вирусных препаратах 37К-форма присутствовала всегда (см. рис. 1, (+)-дорожка).

Методом иммуноблоттинга определяли наличие двух форм капсидного белка ХВШ в очищенных вирусных препаратах и в различных компартментах клеток

Рис. 1. Иммуноблоттинг экстрактов различных частей растений шалота, инфицированных Х-вирусом шалота: 1 и 2 — экстракт корней соответственно через 10 и 30 сут; 3 и 4 — экстракт листьев соответственно через 10 и 30 сут после посадки; (+) — вирусный препарат, выделенный из зрелых листьев растений шалота.

корней и ювенильных листьев прорастающих луковиц на 5-е сут после высадки в грунт (рис. 2). В очищенных вирусных препаратах и во всех исследованных компар-тментах клеток ювенильных листьев выявлена в основном (а во многих экспериментах и исключительно) 37К-форма капсидного белка. В соответствующем материале, полученном из корней, напротив, была обнаружена 28К-форма капсидного белка, тогда как 37К-форма присутствовала только во фракции митохондрий (см. рис. 2А, дорожка 2). Аналогичные результаты были получены при анализе экстрактов из корней и зрелых листьев шалота на более поздней стадии инфекции — на 23-и сут после высадки луковиц в почву (см. рис. 2, В и Г).

,37 К

28 К

^37 К

,28 К

Рис. 2. Иммуноблоттинг экстрактов различных компартментов клеток корней (А и В) и листьев (Б и Г) растений шалота на стадии инициации (А и Б) и поздних стадиях (В и Г) ХВШ-инфекции. А, Б и Г: 1 — очищенный препарат ХВШ; 2, 3 и 4 — фракция соответственно митохондрий, пероксисом и микросом. В: 1 — очищенный препарат ХВШ; 2, 3, 4 и 5 — фракция соответственно клеточных стенок, митохондрий, пероксисом и микросом. Детекцию белковых фракций осуществляли прямым флюоресцентным методом с использованием антикроличьих иммуноглобулинов, конъюгированных с флюоресцентным красителем Cy3.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в корнях и листьях шалота функционируют альтернативные механизмы экспрессии гена капсидного белка ХВШ. В листьях имеет место интенсивный синтез 37К-формы капсидного белка, который присутствует во всех исследованных компартментах инфицированных клеток и входит в состав вирусных частиц. В корнях вирионы формируются при участии 28К-формы капсидного белка, тогда как 37К-форма накапливается в митохондриях и не включается в состав вирусных частиц. Тонкая структура образующихся в корнях вирионов не исследована, и остается неясным, к какому из двух описанных нами ранее морфологических классов вирионов ХВШ относятся образующиеся в корнях шалота вирусные частицы (7).

Детали молекулярных альтернативных механизмов синтеза двух форм капсидного белка ХВШ в различных органах растений шалота неизвестны. Не исключено, что в корнях и листьях инфицированных растений механизмы транскрипции вирусной геномной РНК различаются, в результате чего образуется две формы субге- номных РНК, служащих матрицами для синтеза капсидного белка. Ключевую роль в этих процессах могут играть растительные белки, обладающие функцией органоспецифических факторов транскрипции (16). Показано, что процесс репродукции вируса табачной мозаики в корнях Nicotiana benthamiana ингибируется в результате действия защитного механизма по типу «умолчания генов», запускаемого мобильным сигналом в клетках корневой меристемы и активирующемся вновь в результате действия супрессора вируса погремковости табака (13). Представленные нами данные позволяют предположить, что 37К-форма капсидного белка ХВШ в процессе вирусной инфекции обладает бинарной функцией и в корнях функционирует не как собственно капсидный белок (вирионы с участием 37К-формы в корнях не формируются), а как фактор, связывающий образующийся в клетках корневой меристемы мобильный сигнал, выяснение природы которого требует дополнительных экспериментов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    V i s h n i c h e n k o V.K., K o n a r e v a T.N., Z a v r i e v S.K. A new filamentous virus in shallot. Plant Pathology, 1993, 42: 121-126.

• 2.    Z a v r i e v S.K., V i s h n i c h e n k o V.K. Genus Allexivirus . In Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the ICTV. San Diego, 2002.

• 3.    A d a m s M.J., A n t o n i w J.F., B a r - J o s e p h M. e.a. The new plant virus family Flexiviridae and assessment of molecular criteria for species demarcation. Archives of Virology , 2004, 149: 1213-1217.

• 4.   Allium Crop Science: Recent Advances /Eds. H.D. Rabinowitch, L. Currah. Israel, 2002.

• 5.   Ч е р е м у ш к и н а Н.П., Ш и ш к и н а М.С., Л у к о н и н а Е.И. Использование листовых луков в

  селекции устойчивых к заболеваниям сортов шалота. Докл. РАСХН, 1989, 3: 41-44.

• 6.    K a n y u k a K.V., V i s h n i c h e m k o V.K., L e v a y K.E. e.a. Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5'-proximal cistrons closely related to those of potexviruses and a unique arrangement of 3'-proximal cistrons. J. Gen. Virol., 1992, 73: 2553-2560.

• 7.    В и ш н и ч е н к о В.К., С т е л ь м а щ у к В.Я., З а в р и е в С.К. Исследование морфологической гетерогенности частиц Х вируса шалота в условиях моновирусной инфекции. Мол. биол., 1996, 30: 959-968.

• 8.    V a n D i j k P., V e r b e e k M., B o s L. Mite-borne virus isolates from cultivated Allium species, and their classification into two new rymoviruses in thq family Potyviridae. Netherland J. of Plant Pathol., 1991, 97: 381-399.

• 9.    V a n D i j k P., V a n der V l u g t R.A.A. New mite-borne virus isolates from rakkyo, shallot and wild leek species. European J. of Plant Pathol., 1994, 100: 269-277.

• 10.    S u m i S-I., T s u n e y o s h i T., F u r u t a n i H. Novel rod-shaped virus isolated from garlic , Allium sativum, possessing a unique genome organization. J. of General Virol., 1993, 74: 1879-1885.

• 11.  В и ш н и ч е н к о В.К., А р у ш а н о в а Е.С., К е л д ы ш М.А. и др. Серологически родственный

• 12.  Б а й к а л о в а О.С., В и ш н и ч е н к о В.К., К е л д ы ш М.А. и др. Обнаружение аллексивирусов

• 13.    V a l e n t i n e T.A., R o b e r t s I.M., O p a r k a K.J. Inhibition of tobacco mosaic virus replication in lateral roots is dependent on an activated meristem-derived signal. Protoplasma, 2002, 219: 184-196.

• 14.    G u a l b e r t o J.M., H a n d a H., G r i e n e n b e r g e r J.M. Isolaton and fractionation of plant mitochondria and chloroplasts: specific examples. Methods in Cell Biology, 1995, 50: 161-175.

• 15.    Fluorescent Western Blotting. Application Note 63-0043-05 2001: 1-4.

• 16.    G u t i e r r e z R.A., G r e e n P.J., K e e g s t r a K. e.a. Phylogenetic profiling of the Arabidopsis thaliana proteome: what proteins distinguish plants from other organisms?. Genome Biology, 2004, 5, R53: 1-16.

Х вирусу шалота (ХВШ) гибкий нитевидный вирус в растениях, не принадлежащих к роду Allium .

Докл. РАСХН, 1999, 2: 23-25.

в составе вирусных комплексов, поражающих декоративные луковичные растения. Докл. РАСХН,

2002, 1: 11-13.

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии, 127550, Москва, Тимирязевская ул., 42