Экспрессия генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в тканях опухолей у больных раком гортани и гортаноглотки

Рак гортани и гортаноглотки занимает первое место среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя от 65 до 70 %. Заболеваемость раком гортани в последнее десятилетие имеет тенденцию к росту [6]. Метастазирование плоскоклеточных карцином гортани и гортаноглотки представляет серьезную проблему в связи с тем, что часто встречаются высокоагрессивные опухоли с метастазами при малых размерах новообразования.

Согласно современным представлениям о механизмах метастазирования, для инвазивного роста опухолевым клеткам необходимо преодолевать ба- рьеры в виде базальных мембран, экстраклеточного матрикса и тканевых структур. Кроме деградации экстраклеточного матрикса, в метастазировании ключевую роль играют процессы разрушения адгезивных контактов и приобретение подвижности опухолевых клеток. Для этого малигнизированные клетки вырабатывают протеолитические ферменты. Матриксные металлопротеиназы (ММП), как принято считать, являются основными протеолитическими ферментами, способствующими метастазированию раковых клеток [1, 4].

Установлено, что ММП не только разрушают основные белки экстраклеточного матрикса и базальной мембраны, но и стимулируют миграцию злокачественных клеток, принимают участие в регуляции неоангиогенеза, обеспечивающего дополнительные пути эвакуации клеток первичной опухоли [5, 13], а также угнетают противоопухолевый иммунный надзор [14]. ММП-2 и ММП-9 способны гидролизовать основной структурный белок базальной мембраны – коллаген IV типа, поэтому в настоящее время эти ферменты стали рассматриваться в качестве факторов прогноза метастазирования [8]. ММП-14 является мембраносвязанным ферментом и принимает участие не только в деградации белков стромы, но и в расщеплении межклеточных контактов, а также в увеличении подвижности опухолевых клеток [15]. Каталитическая активность ММП может быть ограничена тканевыми ингибиторами металлопро-теаз (ТИМП), которые связываются с про-ММП и активными ММП стехиометрически, ингибируя, таким образом, как автокаталитическую активацию латентных форм ММП, так и активные ферменты. Взаимосвязь изменения экспрессии MMП на уровнях мРНК и белка с плохим клиническим прогнозом в различных типах рака широко обсуждается многими авторами. Показана прогностическая значимость определения ММП и ТИМП в сыворотке крови больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи [2]. У больных с раком гортани наблюдалась корреляция между экспрессией генов ММП-2 и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы [10]. В отношении экспрессии генов других ММП и ТИМП такие исследования не проводились. Раннее выявление метастазов и рецидивов злокачественного процесса является необходимым условием для адекватного выбора тактики лечения больных, улучшения его результатов и прогноза заболевания.

Целью исследования явилась оценка экспрессии генов матриксных металлопротеиназ (ММП-2,-9,-14) и их тканевых ингибиторов (ТИМП-1,-2) в злокачественных новообразованиях гортани и гор-таноглотки в связи с клинико-морфологическими параметрами заболевания.

Материал и методы

В работе представлены результаты исследования 80 больных со злокачественными новообразованиями гортани и гортаноглотки (стадии T1–3N0–3M0), находившихся на обследовании и лечении в НИИ онкологии г. Томска. Во всех случаях опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточной карциномы разной степени дифференцировки. Все пациенты до настоящего исследования не получали никакого специального лечения. Забор материала для комплексного морфологического исследования с целью верификации диагноза, а также исследования экспрессии генов опухолеассоциированных протеаз и их ингибиторов проводился при фибро-ларингоскопии. Кроме того, у всех пациентов забирался образец неизмененной ткани, находящийся не далее чем в 2 см от опухоли.

Выделение РНК проводили гуанидинфенольным методом (Chomczynski and Sacchi, 1987) [7]. Для анализа уровня экспрессии генов ММП-2,-9,-14 и ТИМП-1,-2 использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (РВ-ПЦР) с праймерами производства фирмы Sintol (Москва) (табл. 1). Для каждого исследуемого образца реакцию РВ-ПЦР проводили в трех повторах одновременно. Реакционная смесь при проведении ПЦР-реакции (суммарный объем 25 мкл) содержала дНТФ 2,5 мМ (2,5 мкл), 10хПЦР буферБ (2,5 мкл), Mg Cl2 25мМ (2,5 мкл), смесь праймеров 10 пкмоль/мкл (0,5–1,0мкл), флуоресцентный зонд 10 пкмоль/мкл (0,1–0,5), Tag ДНК-полимераза, 5 Е/мкл (0,2–0,5 мкл), образец ДНК (1–5 мкл), деионизированная вода до 25,0 мкл. Реакцию проводили на амплификаторе Rotor-gene 6000 (Австралия). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводили нормализацию продуктов амплификации исследуемых генов, был выбран ген «домашнего хозяйства» GAPDH.

Статистический анализ был проведен с использованием программы STATISTICA 6.0. (с использованием двухстороннего непараметрического теста Манна–Уитни). Наличие связи между изучаемыми признаками исследовали с использованием корреляционного анализа и оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R).

Результаты и обсуждение

При анализе полученных результатов было выявлено, что экспрессия генов ММП-2,-9,-14 и ТИМП-1,-2 определялась во всех исследуемых опухолевых образцах и в неизмененной ткани. Обнаружено, что уровень экспрессии исследуемых генов в опухолевой и прилежащей неизмененной ткани достоверно различался только для гена ММП-2 (табл. 2). Нужно отметить, что отсутствие различия в экспрессии исследуемых генов в малигнизированной и неизмененной ткани, по-видимому, может говорить об увеличении деструктивного потенциала не только опухоли, но и прилежащей к ней нормальной ткани, что может увеличивать инвазив-ность и метастататический потенциал опухоли, что согласуется с литературными данными [4].

Исследование экспрессии генов ММП и ТИМП в зависимости от размера первичной опухоли позволило выделить две группы показателей, которые имели сходные закономерности изменения параметров. Так, не было зарегистрировано достоверных различий в экспрессии ММП-2, -14 и ТИМП-1 при увеличении Т-стадии процесса (рис. 1). В противоположность этому получена волнообразная зависимость экспрессии генов ММП-9 и ТИМП-2 от Т-стадии (рис. 2). При увеличении распространенности опухоли до Т2 наблюдалось значимое снижение экспрессии генов и возрастание этих параметров при Т3 по сравнению с опухолями Т2. Показана положительная корреляционная зависимость между размером опухоли и уровнем экспрессии гена ММП-14 (р=0,0009, R=0,39) и ТИМП-2 (р=0,001, R=0,6). В целом, полученные

Таблица 1

Объект	Наименование	5-3 последовательность
ММП-2	Sense	Ttc-ttc-aag-gac-cgg-ttc-att
	AntiStnse	Agt-cgg-att-tga-tgc-ttc-caa
ММП-9	Sense	Gtc-ttg-tgg-agg-ctt-tga-g
	AntiStnse	Aga-cac-cag-tgc-ttt-ctg-ac
ММП-14	Sense	Tgg-agg-aga-cac-cca-ctt-tga
	AntiStnse	Gcc-acc-agg-aag-atg-tca-ttt-c
ТИМП-1	Sense	Ggc-ttc-acc-aag-acc-tac-a
	AntiStnse	Ttg-cag-ggg-atg-gat-aaa
ТИМП-2	Sense	Tgg-act-ctg-gaa-acg-aca-t
	AntiStnse	Tct-cag-gcc-ctt-tga-aca-t
GAPDH	Sense	Ctc-aac-ggg-aag-ctc-act-gg
	AntiStnse	Agg-tca-gat-cca-caa-ccg-aca
ММП-2 probe	(ROX)	(ROX)ttt-gat-gcg-gta-tac-gag-gcc-cca-ca(BHQ2)
ММП-9 probe	(FAM)	(FAM)gt-gaa-cag-ggg-caa-acc-tta-(RTQ1)
ММП-14 probe	(FAM)	(FAM)tct-gcc-gag-cct-tgg-act-gtc-agg--(BHQ1)
ТИМП-1 probe	(ROX)	(ROX)gg-ctg-tga-gga-atg-cac-(BHQ2)
ТИМП-2 probe	(FAM)	(FAM)tg-gca-acc-cta-tca-aga-g-(RTQ1)
GAPDH probe	(Cy5)	(Cy5)tt-ccg-tgt-ccc-cac-ccc-caa--(BHQ2)

Таблица 2

Объект исследования	ММП-2 p=0,03	ММП-9 p>0,05	ММП-14 p>0,05	ТИМП-1 p>0,05	ТИМП-2 p>0,05
Опухолевая ткань	1,51 ± 0,17 n=45	1,66 ± 0,24 n=11	1,24 ± 0,12 n=65	1,28 ± 0,09 n=34	1,2 ± 0,25 n=23
Неизмененная ткань	0,94 ± 0,14 n=6	1,53 ± 0,22 n=4	1,33 ± 0,37 n=11	1,33 ± 0,43 n=8	1,09 ± 0,15 n=8

Примечание: р – значимость различий между опухолевой и неизмененной тканями. СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2012. №1 (49)

Нуклеотидные последовательности для изучения экспрессии генов ММП-2, -9, -14 и ТИМП-1, -2

Экспрессия генов ММП и ТИМП в опухолевой и неизмененной тканях

Рис. 1. Изменение экспрессии генов ММП-2, -14 и ТИМП-1 в зависимости от местной распространенности опухоли

Рис. 2. Изменение экспрессии генов ММП-9 и ТИМП-2 в зависимости от местной распространенности опухоли. Примечания: * – различия статистически значимы между группами больных с Т1 и Т2 (р<0,05);

** – различия статистически значимы между группами больных с Т2 и Т3 (р<0,05)

ММП-2 ММП-9 ММП-14 ТИМП-1 ТИМП-2

□ NO                ■ N1-3

Рис. 3. Изменение экспрессии генов в зависимости от выраженности лимфогенного метастазирования.