Экспрессия иммуногистохимических маркеров в аденокарциноме простаты после максимальной андрогенной блокады

Введение. Проблема рака простаты (РП) приобретает особую актуальность вследствие неуклонного роста заболеваемости и смертности, а также в связи с трудностями своевременной диагностики. РП занимает второе место среди злокачественных новообразований у мужчин. Несмотря на улучшение методов диагностики и внедрение ПСА-мониторинга, заболеваемость запущенными формами РП в России остается на высоком уровне. В последние десятилетия эффективность лечения онкологических больных по показателям длительной выживаемости и продолжительности жизни изменяется незначительно [2]. Лечебный патомор-фоз – это типовые и стойкие изменения клинических и морфологических проявлений опухоли под воздействием лечения. Неоспоримым методом оценки степени развития лечебного патоморфоза после воздействия на ткань простаты является гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Положительный патоморфоз РП, выявляемый при рутинных гистологических методах окраски, не дает достоверной информации об эффективности данного метода лечения. В качестве дополнительного критерия эффективности лечения РП необходимо применение иммуногистохимических методов исследования [5, 6].

Цель: изучение степени выраженности патоморфоза аденокарциномы простаты при помощи иммуногистохимических маркеров после максимальной андрогенной блокады (МАБ).

Материалы и методы. В данной работе мы изучали материал, полученный от 40 пациентов с диагнозом ацинарная аденокарцинома простаты до и через 4 месяца после лечения МАБ. До лечения мы изучали материал трансректальной биопсии простаты, после – трансуретральной резекции простаты. МАБ проводилась билатеральной орхэктомией. Иммуногистохимические реакции проводили на парафиновых срезах, используя стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детекционной системы применяли систему LSAB2 System, HRP (K0675) фирмы Daco, в качестве хромогена – диаминобензидин (Daсo). В работе использовали следующие антитела: Monoclonal Mouse Anti-Human Androgen Receptor Clone AR 441-фирма Daco (разведение 1:50); P53 Mouse Monoclonal Antibody – фирма CELL MARQUE (разведение 1:100); Monoclonal Mouse Anti-Human Ki67 Antigen Clone MIB-1– фирма Daco (разведение 1:100); AMACR Rabbit Polyclonal Antibody RP 134 R – фирма Diagnoatic BioSystems (разведение 1:50); Monoclonal Mouse anti Bcl-2 oncoprotein – фирма Daco (разведение 1:50). Результаты реакций цитоплазматических маркеров (AMACR, Вcl2) оценивали полуко-личественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью светового бинокулярного микроскопа «MicrosMC100», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция маркера. Результаты экспрессии с ядерными антигенами (Р53, Andr) оценивали по системе подсчета histochemical score (Hs). Формула подсчета следующая:

histochemicalscore (Hs) = ∑ P (i) × i, где i – интенсивнось окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3. P (i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Интенсивность окраски: 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2 – умеренное окрашивание, 3 – сильное окрашивание.

Для определения индекса пролиферации экспрессии ядерного маркера Ki67 выполняли подсчет количества окрашенных ядер клеток опухоли, учитывая процентное соотношение окрашенных\неокрашенных ядер клеток на 100 учтенных клеток в 10-ти репрезентативных полях зрения при увеличении х40. Статистический анализ проводили с использованием программы статистической обработки SSPS 13.0 forWindows, критерия Манна – Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение. Опухолевый маркер Ki-67 является одним из наиболее востребованных в онкологии для определения пролиферативной активности опухолевых клеток, степени злокачественности новообразования и решения вопроса о виде дополнительного консервативного лечения [3]. Мы изучали экспрессию данного маркера как до, так и после МАБ. До лечения индекс пролиферации опухолевых клеток был во всех случаях на достаточно высоком уровне и колебался от 42 % до 96 % (медиана 61 %). После МАБ показатели индекса пролиферации заметно снижались и находились в пределах от 0 % до 27 % (медиана14 %). Сравнивая показатели двух групп по критерию Манна – Уитни, мы получили существенные различия.

Альфа-метилацил-КоА-рацемаза (AMACR) специфичный высокоэффективный иммуногистохимический онкомаркер, позволяющий дифференцировать рак простаты от других патологических процессов, а также более точно определить стадию заболевания [1]. В нашем исследовании до лечения у 97 % пациентов в аденокарциноме отмечали сильную (3 балла) реакцию данного маркера в виде зерен коричневого цвета в цитоплазме, у 3 % пациентов – умеренную реакцию. После лечения у 53 % пациентов реакция данного маркера была слабая (1 балл), у 34 % – умеренная (2 балла), и лишь у 13 % пациентов экспрессия оставалась на высоком уровне (3 балла). Сравнивая показатели двух групп по критерию Манна – Уитни, мы получили существенные различия в уровнях выборок. Экспрессия AMACR находилась в прямой корреляции с маркером пролиферации Ki-67.

Рис. 1. Умеренная иммуногистохимическая реакция с антителом к AMACR в аденокарциноме простаты после лечения МАБ.Ув. 246,4

Рис. 2. Выраженная иммуногистохимиче с кая реакция с а н тителом к AMACR в аденокарциноме простаты до лечения МАБ.Ув. 492,8

Р53 иммуногистохимический маркер является супрессором опухолевого р оста. Предотвращает вступление клетки с поврежденной ДНК в фазу цикла и индуцирует апоптоз.

Мутация гена р53 ведет к потере контроля пролиферации клеток, угнетению апоптоза. Величина экспрессии мутированного р53 при РП зависит от того, состоит ли она из гормонозависимых клеток или образована гормононезавис и мыми клетками [1]. У пациентов до лечения МАБ в аденокарциноме реакция данного маркера колебалась в пределах Hs = от 200 до 72 (медиана 120). После лечения показатели экспрессии снижались: медиана Hs = 61, но интервал колебания экспрессии данного показателя составлял от Hs = 13 до 255. Сравнивая показатели групп по критерию Манна – Уитни мы получили, что различия в уровн я х выборок были не существенными. Антиген Всl-2 экспрессируется в цитоплазме и на база л ьной мембране эпителия и является регулятором апоптоза. Ген Вс1-2 способствует опухолевой прогрессии, ингибируя апоптоз и тем самым повыша я выживаемость опухолевых клеток [4]. В нашем исследовании реакция данного маркера в аденокарциноме у пац и ентов до М АБ была умеренной (2 балла) и сильной (3 балла) во всех случаях. После лечения у 11 % пациентов экспрессия оставалась сильной, у 42 % пациентов отмечали умеренную экспрессию, у 35 % – слабую, и у 12 % экспрессия в аденокарциноме была отрицательной. Использу я критерий Манна – Уитни, мы выявили, что различия в уровнях выборок являются существенными. У 94 % пациентов после МАБ положительная реакция Вс1-2 отмечалась в лимфоцитах в очагах лимфоцитарной инфильтрации в строме.

Андрогены участвуют в стимуляции пролиферации эпителиальных клеток простаты, а также стимулируют синтез кератинного и фибробластического факторов роста стромальными клетками, что оказывает митогенный эффект на эпителиальные клетки и окружающую строму. До билатеральной орхэктомии реакция данного маркера в аденокарциноме простаты у 72 % пациентов была выраженной (медиана Hs = 226). Через 4 месяца после МАБ медиана Hs составила 88, показатель гистосчета колебался в пределах от 3 до 290. При анализе критерия Манна – Уитни различия в уровнях выборок можно считать существенными. Экспрессия андрогенов находилась в прямой корреляции с экспрессией Ki67 и AMACR.

Рис. 3. Выраженная иммуногистохимическая реакция с антителом к андрогенам в аденокарциноме простаты до лечения МАБ.Ув. 492,8

Рис. 4. Слабая иммуногистохимическая реакция с антителом к андрогенам в аденокарциноме простаты после лечения МАБ.Ув. 492,8

Заключение. Через 4 месяца после МАБ (билатеральная орхэктомия) при иммуногистохимическом исследовании отмечается существенное снижение индекса пролиферации, экспрессии онкомаркера AMACR, ядерной экспрессии андрогенов и маркера регулятора апоптоза Bcl-2 в клетках аденокарциномы простаты. Экспрессия регулятора апоптоза Р53 в ядрах опухолевых клеток после лечения также снижалась, но достоверного различия между группами пациентов до и после МАБ не было. Таким образом, используя иммуногистохимические маркеры мы смогли оценить показатели лечебного патоморфоза, недоступные при стандартной окраске.